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1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 浙江 杭州 310058

中國(guó)藥典2020版中規(guī)定卷柏（Selaginellae Herba）為卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina（Beauv.）spring或墊狀卷柏Selaginella pulvinata（Hook.et Grev.）Maxim.的干燥全草[1]，所以市場(chǎng)上的卷柏藥材植物來源有兩種。卷柏（S.tamariscina）為蕨類卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬（Selaginella）多年生草本植物，功能主要為破血散瘀，活血止血，被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。卷柏干旱時(shí)植株向內(nèi)卷成一團(tuán)，顏色枯黃，一旦遇水，便會(huì)植株伸展、返綠，因此民間常稱其為“九死還魂草”[2-3]。卷柏中含有大量酚酸類化合物，有很強(qiáng)的抗氧化活性，卷柏復(fù)蘇機(jī)理與其抗氧化活性密切相關(guān)[4-5]。卷柏總酚酸含量測(cè)定未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用DNA條形碼技術(shù)鑒定卷柏藥材來源，采用NaOH滴定法和福林酚比色法測(cè)定卷柏總酚酸含量，為卷柏藥材來源的準(zhǔn)確快速鑒定、酚酸類化合物的研究提供參考，為揭示卷柏復(fù)蘇機(jī)理及其綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑：Bio-Rad C1000 PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司）；MAPADA紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；離心機(jī)TGL-16G（上海安亭科學(xué)儀器廠）；5000ml電熱套、循環(huán)水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、萬(wàn)分之一分析天平JA5003B。DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 材料：本實(shí)驗(yàn)選用5個(gè)樣品材料，材料1、2和5分別為2016年11月、5月和9月自山東收集的藥材全草；材料3為2016年11月采自江蘇省連云港的藥材全草；材料4為2016年5月自廣西收集的藥材全草。

2 方法

2.1 分子鑒定：將液氮保存的樣品取出，室溫放置5min，按DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后用Bio-Rad Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng)觀察提取的DNA質(zhì)量并拍照。采用PCR擴(kuò)增[6]，前引物 ：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT，后 引 物 ：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT。反應(yīng)體系為25μl：10×PCR緩沖液 2.5μl，MgCl2（25mmol/L）1.5μl，dNTP（25mmol/L）2μl，引物（10nmol/L）各1μl，Taq酶（5U/μl）0.2μl，DNA模板2μl，ddH2O補(bǔ)充至25μl。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸45s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。得到序列后提交至NCBI經(jīng)由BLAST對(duì)比確定藥材植物來源。

2.2 總酚酸含量測(cè)定：具體如下。

2.2.1 提取方法：取500g材料1干燥切碎，經(jīng)回流提取后依次經(jīng)過PET、EtOAc、n-BuOH萃取，回收溶劑得到不同極性部位。EtOAc部位加5%NaHCO3溶液，得到5%NaHCO3溶液層和油層，5%NaHCO3溶液層加入酸水（1%～3%HCl，調(diào)pH=2），析出沉淀，用EtOAc萃取，回收溶劑得到浸膏（有機(jī)酸類）；油層加1%NaOH溶液，得到1%NaOH溶液層，加入酸水（1%～3%HCl，調(diào)pH=2），析出沉淀，用EtOAc萃取得到浸膏（酚類）；n-BuOH部位處理方法同EtOAc部位，最終分別將EtOAc部位和n-BuOH部位的有機(jī)酸類、酚類合并，得到有機(jī)酸樣品1.60g，酚類樣品0.88g，備用。

2.2.2 有機(jī)酸含量測(cè)定：①標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定液的配制：精密稱取NaOH粉末4.1358g于1000ml容量瓶中，加水溶解后定容，搖勻。精密稱取基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀2.0956g，加水定容，量取10ml鄰苯二甲酸氫鉀溶液，加0.2%酚酞指示液2滴，用新配置的NaOH溶液滴定，至溶液顯粉紅色。重復(fù)滴定3次，取消耗的NaOH平均值，得到配制的NaOH濃度為1.009mol/L。②莽草酸對(duì)照品溶液的制備和滴定：精密稱取莽草酸對(duì)照品12mg于100ml容量瓶中，加適量無(wú)水乙醇溶解并定容即得對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確量取10ml對(duì)照品溶液置燒杯中，加酚酞指示液2滴，用標(biāo)定的NaOH溶液滴定，重復(fù)滴定3次，記錄每次消耗的NaOH溶液的體積，平均消耗NaOH溶液0.15ml。經(jīng)計(jì)算得1ml NaOH溶液相當(dāng)于66.67ml莽草酸溶液，即相當(dāng)于0.0054g莽草酸對(duì)照品。③線性關(guān)系考察：精密移取0、5、10、15、20、25、30ml莽草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于錐形瓶中，用標(biāo)定的NaOH溶液滴定，重復(fù)滴定3次，以NaOH溶液用量（ml）Y為縱坐標(biāo)，莽草酸質(zhì)量（mg）X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.1232X+0.0025，R2=0.9991，線性良好。④供試品溶液的制備：取有機(jī)酸樣品0.0309g于100ml容量瓶中，加少量無(wú)水乙醇溶解并定容，備用。⑤測(cè)定方法：精密吸取供試品溶液5ml于燒杯中，加酚酞指示液2滴，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定樣品中總有機(jī)酸的含量，以莽草酸計(jì)。

2.2.3 酚類化合物含量測(cè)定：①對(duì)照品溶液的制備：精確稱取丁香酸對(duì)照品0.0145g于100ml容量瓶中，蒸餾水溶解并定容，得到濃度為145μg/ml的丁香酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。②供試品溶液的制備：精密稱取樣品0.0934g于100ml容量瓶中，加20ml6%乙醇溶解并定容，備用。③最佳測(cè)量波長(zhǎng)的選擇：精密移取0.5ml的丁香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液，加入蒸餾水5.0ml，混勻后加入福林酚試劑1.0ml，搖勻，靜置30s后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的Na2CO3溶液3.0ml用蒸餾水定容至25ml，25℃下避光反應(yīng)2h后進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，選擇582nm作為最佳測(cè)量波長(zhǎng)。④線性關(guān)系考察：分別精密移取丁香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.25、0.5、0.75、1.00、1.25、1.5ml于25ml容量瓶中，分別加入福林酚試劑3.0ml，搖勻，靜置30s后操作參考“③最佳測(cè)量波長(zhǎng)的選擇”，以0樣為空白對(duì)照，在582nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（μg/ml）X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=0.0108X+0.0121，R2=0.9942，線性良好。⑤碳酸鈉用量的選擇：分別精密移取7份丁香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml于25ml的容量瓶中，福林酚比色法過程中分別加入12%Na2CO3溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，其他條件不變，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，繪制曲線圖，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出福林酚試劑與Na2CO3溶液的最佳體積比。⑥福林酚試劑用量的選擇：分別精密移取6份丁香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml于25ml的容量瓶中，福林酚比色法過程中分別加入福林酚試劑0.25、0.50、1.0、1.5、2.0、2.5ml，12%Na2CO3溶液用量與福林酚試劑相同，其他操作不變，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，繪制曲線圖，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出福林酚試劑的最佳用量。⑦顯色時(shí)間的選擇：精密量取6份供試品溶液1.0ml于25ml的容量瓶中，福林酚比色法過程中加入福林酚試劑2.0ml和相同體積的12%Na2CO3溶液，25℃下分別避光靜置0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0h，其他操作不變，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，繪制曲線圖，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出最佳反應(yīng)時(shí)間。⑧樣品的測(cè)定：精密量取1.0ml供試品溶液，以優(yōu)化的福林酚比色法的最佳條件處理樣品，在582nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，計(jì)算樣品中總酚類化合物的含量，以丁香酸計(jì)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 分子鑒定實(shí)驗(yàn)：提取的5個(gè)DNA樣品經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照結(jié)果（圖1）顯示提取的DNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)測(cè)序，得到的結(jié)果（圖2）與BLAST序列對(duì)比表明5個(gè)樣本中1、3、4、5 為 卷 柏 Selaginellatamariscina（Beauv.）spring，樣本2為墊狀卷柏Selaginella pulvinata（Hook.et Grev.）Maxim，因此選擇樣本1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料。

圖1 卷柏樣品的DNA凝膠電泳圖

圖2 卷柏樣品的ITS2序列圖

3.2 有機(jī)酸含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)：NaOH溶液平均消耗量為0.10ml，計(jì)算出卷柏供試品中有機(jī)酸含量為51.2%。因500g卷柏中共提取到有機(jī)酸樣品1.6g，因此本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得卷柏中有機(jī)酸含量為0.16%。

3.3 酚類化合物含量測(cè)定：具體如下。

3.3.1 碳酸鈉用量的確定：隨著12%Na2CO3溶液用量的增加，吸光度呈不斷增大的趨勢(shì)，當(dāng)12%Na2CO3溶液的體積增加至1.0ml時(shí)，即福林酚試劑與12%Na2CO3溶液的體積比為1∶1時(shí)，吸光度達(dá)到最大，之后基本處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)。因此福林酚試劑與12%Na2CO3溶液的最佳體積比為1∶1（圖3-A）。

3.3.2 福林酚試劑用量的確定：當(dāng)福林酚試劑的用量不斷增加時(shí)，丁香酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度也隨之呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)福林酚試劑的用量增加到1.0ml時(shí)，吸光度達(dá)到最大，隨后變化趨于平緩，因此福林酚試劑的最佳用量為反應(yīng)液的2倍（圖3-B）。

3.3.3 顯色時(shí)間的確定：在2h以內(nèi)的顯色是不完全的，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。2h時(shí)吸光度達(dá)到最大，2h以后吸光度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)下降趨勢(shì)但隨后又基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，說明反應(yīng)2h后顯色完全，因此，顯色完全的最佳時(shí)間為2h（圖3-C）。

圖3 福林酚比色法條件優(yōu)化圖

3.3.4 樣品測(cè)定結(jié)果：樣品的吸光度平均值為0.269，計(jì)算出卷柏樣品中酚類含量為63.67%。因500g卷柏中共提取到酚類樣品0.88g，所以本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得卷柏中酚類含量為0.11%。

4 討論

本文總結(jié)了采取分子鑒定法鑒別5個(gè)藥材的植物來源，結(jié)果證明1、3、4、5均為卷柏S.tamariscina，2為墊狀卷柏S.pulvinata，選擇藥材1作為后續(xù)含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)材料，保證了實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)確性。有機(jī)酸的檢測(cè)采用最傳統(tǒng)的酸堿滴定法，選用卷柏中已經(jīng)分離鑒定的莽草酸做對(duì)照品，可被大部分科研人員所接受，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。所采用的優(yōu)化的福林酚比色法條件試劑用量少，操作簡(jiǎn)單，適宜卷柏樣品總酚類含量的測(cè)定。本次實(shí)驗(yàn)全部采用經(jīng)典測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為卷柏酚酸類成分的研究提供依據(jù)，也為后續(xù)揭示卷柏復(fù)蘇機(jī)理及其綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。