唐明杰 章程 賈亞超 孫玉強(qiáng) 柴益民

帶蒂皮瓣移植技術(shù)是臨床常用的修復(fù)肢體組織缺損的方法。當(dāng)皮瓣切取面積超過(guò)血管蒂的供血范圍時(shí)，常出現(xiàn)因缺血造成的皮瓣部分壞死，影響皮瓣移植效果[1]。因此，增加缺血皮瓣成活面積具有重要的研究意義[2]。小牛血清去蛋白注射液是目前治療缺血性腦血管病的常用藥物，受其可以減輕腦組織缺血再灌注損傷[3-4]和改善供氧、能量供應(yīng)的啟發(fā)，本研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察小牛血清去蛋白注射液對(duì)皮瓣缺血壞死及皮瓣成活面積的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 缺血皮瓣模型建立

取雄性清潔級(jí)SD大鼠36只，4周齡，體質(zhì)量300 g，由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。經(jīng)1%戊巴比妥(1 mL/100 g)麻醉成功后，在大鼠背部設(shè)計(jì)遠(yuǎn)端蒂隨意皮瓣，長(zhǎng)3 cm，寬10 cm，在深筋膜下將皮瓣掀起，徹底止血后使用4-0縫線(xiàn)將皮瓣縫回原處。

1.2 動(dòng)物分組及處理

將上述大鼠隨機(jī)分為3組，分別于術(shù)后當(dāng)天經(jīng)腹腔注射不同藥物，每天1次，持續(xù)給藥14 d。實(shí)驗(yàn)組給予不同濃度的小牛血清去蛋白注射液(奧德金，錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司)，其中實(shí)驗(yàn)1組給予小牛血清去蛋白注射液30 mg/kg，實(shí)驗(yàn)2組給予小牛血清去蛋白注射液45 mg/kg，而對(duì)照組給予生理鹽水。所有大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，正常進(jìn)食和活動(dòng)。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 大體觀察

術(shù)后14 d，根據(jù)皮瓣外觀、質(zhì)地、針刺后出血反應(yīng)判斷皮瓣成活情況。標(biāo)記皮瓣壞死-成活界限，拍照后統(tǒng)計(jì)皮瓣存活及壞死面積，并計(jì)算皮瓣存活率。

1.3.2 組織學(xué)檢查

術(shù)后14 d，對(duì)壞死邊界組織取材并進(jìn)行HE染色，觀察皮膚組織結(jié)構(gòu)，利用免疫組化染色(CD31、CD34、vWF)檢測(cè)血管再生情況。將標(biāo)本固定于10%福爾馬林液，用石蠟包埋，切成 5 μm 厚的切片。于梯度酒精脫蠟至水，加入枸櫞酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，用抗CD31、CD34及vWF多克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，并用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。于光學(xué)顯微鏡下檢查，并比較各組結(jié)果。

1.3.3 凋亡基因及成血管基因檢測(cè)

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)凋亡基因BCL-2、BAX及成血管基因eNOS表達(dá)。在組織中加入1 mL Trizol試劑研磨徹底后，取上清。根據(jù)說(shuō)明書(shū)指示提取總RNA。然后，取 1 μg RNA 樣本用Amv逆轉(zhuǎn)錄酶與 oligo dt15 一起逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。使用 Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑 (Invitrogen, USA)在 7 500 real time PCR 系統(tǒng)(ABI, Invitrogen, USA)完成實(shí)時(shí)定量 PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)BCL-2、BAX、eNOS等相關(guān)基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

所有SD大鼠均成活，無(wú)感染或死亡。術(shù)后14 d皮瓣壞死界限清晰，實(shí)驗(yàn)1組和2組皮瓣成活率分別為62.2%±6.3%和64.9%±3.5%，均顯著優(yōu)于對(duì)照組(47.8%±1.7%)(P<0.01)，其中實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 組織學(xué)觀察

HE和免疫組化染色顯示，實(shí)驗(yàn)1組和2組皮膚結(jié)構(gòu)及新生血管數(shù)量均明顯優(yōu)于對(duì)照組(圖1)。定量分析顯示，實(shí)驗(yàn)1組和2組新生血管標(biāo)記物CD31、CD34、vWF密度顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組CD31密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，CD34及vWF密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖1 HE及免疫組化染色(×200)

圖2 免疫組化定量分析

2.3 相關(guān)基因檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)1組和2組凋亡指標(biāo)BCL-2及BAX基因表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)(P<0.05)，而3組成血管基因eNOS表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05) (圖3)，提示小牛血清去蛋白注射液可以下調(diào)凋亡基因表達(dá)，但對(duì)血管指標(biāo)基因表達(dá)無(wú)影響。

圖3 BCL-2、BAX及eNOS基因檢測(cè)

3 討論

皮瓣移植是修復(fù)重建外科治療軟組織缺損的重要方法。盡管皮瓣外科學(xué)技術(shù)已較成熟，但當(dāng)皮瓣切取面積過(guò)大或修復(fù)距離較遠(yuǎn)時(shí)，仍會(huì)出現(xiàn)皮瓣遠(yuǎn)端缺血壞死的現(xiàn)象，這也是皮瓣手術(shù)最常見(jiàn)的并發(fā)癥。皮瓣移植后，皮瓣血運(yùn)重建有多種途徑，主要包括蒂部血管供氧、皮瓣內(nèi)原有血管擴(kuò)張、皮瓣內(nèi)新生血管生成及受區(qū)基底和周邊新生血管長(zhǎng)入。當(dāng)?shù)俨垦芄┭蛔銜r(shí)，其他途徑便成為皮瓣成活的重要因素。近年來(lái)已有多種方法如皮瓣延遲技術(shù)、全身或局部藥物、細(xì)胞移植、生長(zhǎng)因子、基因治療、體外震波治療等用于改善皮瓣手術(shù)后血供[5-8]。本研究采用小牛血清去蛋白注射液增加大鼠腹腔缺血皮瓣成活面積，為其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

小牛血清去蛋白注射液改善腦及外周神經(jīng)功能的作用及安全性已得到臨床認(rèn)可[4]。它是從發(fā)育旺盛的健康小牛血清中提取的一種生物活性物質(zhì)，包含小分子激活肽、磷酸肌醇寡糖、氨基酸、脂類(lèi)等。一般認(rèn)為，前兩者是其主要有效成分。在低氧條件下，細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖會(huì)發(fā)生無(wú)氧糖酵解，產(chǎn)生大量乳酸，乳酸會(huì)進(jìn)一步影響細(xì)胞功能，加重細(xì)胞損傷。而磷酸肌醇寡糖則可以促進(jìn)和改善組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取利用，使葡萄糖利用由無(wú)氧酵解向有氧氧化轉(zhuǎn)化，通過(guò)三羧酸循環(huán)和呼吸鏈產(chǎn)生大量能量，既增加了葡萄糖的利用率，又降低了代謝產(chǎn)物對(duì)組織的損害，為細(xì)胞修復(fù)和再生提供了良好條件[3]。李娟等[9]研究小牛血清去蛋白注射液對(duì)急性重型顱腦損傷患者腦脊液乳酸濃度的影響，結(jié)果顯示治療組乳酸含量從第3天開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降，治療組患者遠(yuǎn)期預(yù)后也優(yōu)于對(duì)照組。

本研究顯示，實(shí)驗(yàn)1組和2組皮瓣平均缺血壞死面積占比較對(duì)照組分別減小14.4%和17.1%，成活率較對(duì)照組分別提高了30.1%和35.8%；組織學(xué)檢測(cè)表明，經(jīng)小牛血清去蛋白注射液治療后缺血皮瓣中有更多的新生血管生成；進(jìn)一步的基因檢測(cè)結(jié)果提示，小牛血清去蛋白注射液通過(guò)下調(diào)調(diào)亡基因表達(dá)，穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境，而非通過(guò)直接上調(diào)成血管基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。這表明小牛血清去蛋白注射液在改善缺血皮瓣再生方面起著積極的作用。此結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道的小牛血清去蛋白注射液在腦梗塞治療中起作用相輔[10]，即其可有效抑制炎癥因子過(guò)度反應(yīng)，降低機(jī)體損傷性反應(yīng)，但對(duì)血管再生基因無(wú)明顯調(diào)控作用。

綜上所述，小牛血清去蛋白注射液可以通過(guò)下調(diào)缺血皮瓣凋亡基因表達(dá)，改善皮瓣缺血狀態(tài)下細(xì)胞能量代謝，從而促進(jìn)皮瓣新生血管生成，達(dá)到增加皮瓣成活面積的治療目的。