張遠(yuǎn)洋 王梅芳 董銀萍 吳靜 王欣悅 李文璇 李德冠

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室 300192

隨著社會與科技的進(jìn)步，核技術(shù)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和軍事等領(lǐng)域。電離輻射會對機(jī)體造成急性、慢性或持久性損傷。造血系統(tǒng)因其對輻射的敏感性使其在輻射損傷的治療中起著重要作用。造血生長因子（例如粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）目前已獲得美國食品和藥物管理局的批準(zhǔn)用于治療造血系統(tǒng)的輻射損傷[1]。然而，應(yīng)用造血生長因子不僅會導(dǎo)致發(fā)燒、疼痛和嘔吐等，而且會破壞造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）的自我更新能力，從而加速HSC的耗竭并進(jìn)一步影響造血系統(tǒng)的長期恢復(fù)。因此，造血系統(tǒng)輻射損傷的治療方法研究仍需進(jìn)一步開展。

西格列?。╯itagliptin）是廣泛用于臨床治療2型糖尿病的藥物[2-4]。前期研究結(jié)果表明，西格列汀可以降低急性胰腺炎、糖尿病心肌病、慢性腦灌注不足、心力衰竭和肝缺血再灌注等疾病中的氧化應(yīng)激水平[5-9]。Broxmeyer 等[10]發(fā)現(xiàn)，提前給予小鼠西格列汀或敲除二肽基肽酶4（DPP4），可增強(qiáng)輻射暴露后機(jī)體的造血能力恢復(fù)。然而，西格列汀在造血系統(tǒng)輻射損傷中的治療效果和機(jī)制尚待研究。

本研究在觀察西格列汀對正常小鼠外周血血象是否有影響的基礎(chǔ)上，探究了西格列汀在小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷中的治療效果，為尋找造血系統(tǒng)輻射損傷的潛在治療藥物研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6 純系小鼠，6～8 周齡，雄性，體重20～22 g，購自北京華阜康實驗動物中心，許可證號：SCXK（京）2014-0003。小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所無特定病原體級動物房，自由飲用無菌水和進(jìn)食無特定病原體級鼠繁殖飼料，飼養(yǎng)溫度 18～25℃，相對濕度40%～70%。

1.2 主要儀器與試劑

Gammacell?40 Exactor137Cs γ 射線照射源購自加拿大Best Theratronics 公司，劑量率為1.01 Gy/min；MEK-7222K 全自動血液分析儀購自日本光電工業(yè)株式會社；Accuric 6 型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。西格列汀購自美國默沙東公司。胎牛血清購自美國Gibco 公司。2′,7′-二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甲基纖維素培養(yǎng)基M3534 購自加拿大Stem Cell Technologies 公司；一抗和二抗購自美國eBioscience公司和Biolegend 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥

本課題組前期的預(yù)實驗研究結(jié)果顯示，與對照組相比，西格列汀單獨給藥組各項指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，因此，在本研究中，僅設(shè)置對照組。將15 只C57BL/6 雄性小鼠按照區(qū)組隨機(jī)法分為對照組、照射組和西格列汀+照射組，每組5 只。照射組和西格列汀+照射組小鼠均接受7 Gy137Cs γ 射線一次性全身照射。西格列汀+照射組于照射后2 h開始灌胃給藥，給藥劑量為10 mg/kg，每只0.2 mL，連續(xù)給藥7 d，對照組和照射組給予等量生理鹽水。照射后第30 天頸椎脫位法處死小鼠，進(jìn)行相關(guān)分析。

1.3.2 外周血血象的分析

小鼠眼靜脈叢取外周血，滴入到含有抗凝劑的EP 管中，用血液分析儀測定WBC、RBC、血小板（platelet, PLT）計數(shù)和血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、紅細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）水平等指標(biāo)。

1.3.3 骨髓有核細(xì)胞（bone marrow nucleated cell，BMNC）計數(shù)

無菌條件下取小鼠單側(cè)股骨，用含2%胎牛血清的PBS 沖洗后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.3.4 骨髓細(xì)胞分型的檢測

取1×106個骨髓細(xì)胞，加入biotin 標(biāo)記的混合一抗（CD4、CD8、Ter119、CD11b、CD45R/B220和Gr-1），4℃避光孵育30 min，洗滌1 次后棄上清，加入混合二抗（streptavidin-Percp、Sca1-PE 和c-kit-APC）染色，4℃避光孵育30 min，洗滌1 次后棄上清，重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測并統(tǒng)計造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cell, HPC）（lin?ckit+Sca1?）和HSC（lin?c-kit+Sca1+）的百分比及數(shù)量。

1.3.5 骨髓細(xì)胞克隆形成能力的檢測

取骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/mL，加入至甲基纖維素培養(yǎng)基M3534 中后緩慢接種到24 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6 個平行孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)5 d 后，計數(shù)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位（colony-forming units granulocyte-macrophage，CFU-GM）的克隆數(shù)，以≥50 個細(xì)胞群為陽性克隆，結(jié)果以每105個骨髓細(xì)胞生成的CFU-GM 克隆數(shù)表示。

1.3.6 活性氧的檢測

將骨髓細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測，平均熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞中活性氧水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2 組間的比較采用獨立樣本t檢驗（方差齊）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西格列汀對照射后小鼠BMNC 及外周血血象的影響

由表1 可知，與對照組相比，照射組小鼠BMNC、外周血WBC、RBC、PLT 計數(shù)和HGB、HCT 水平均顯著減少、降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.476～12.200，均P<0.05）；與照射組相比，西格列汀+照射組小鼠的BMNC 和WBC 計數(shù)均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。以上結(jié)果提示西格列汀可促進(jìn)輻射暴露后的骨髓細(xì)胞及外周血的恢復(fù)。

表1 西格列汀對7 Gy γ 射線全身照射后小鼠外周血血象及骨髓有核細(xì)胞的影響（ ±s）Table 1 Effect of sitagliptin on peripheral blood hemogram and bone marrow nucleated cells of mice exposed to 7 Gy γ-ray whole-body irradiation ( ±s)

表1 西格列汀對7 Gy γ 射線全身照射后小鼠外周血血象及骨髓有核細(xì)胞的影響（ ±s）Table 1 Effect of sitagliptin on peripheral blood hemogram and bone marrow nucleated cells of mice exposed to 7 Gy γ-ray whole-body irradiation ( ±s)

注：表中，a 表示與對照組比較，t=2.510～12.200，均P<0.05；b 表示與照射組比較，t=4.593、7.020，均P<0.05

紅細(xì)胞比容（%）對照組（n=5） 20.5±2.2 11.7±2.2 9.2±0.4 443.6±68.4 131.0±5.8 31.2±1.2照射組（n=5） 8.0±1.0a 3.0±0.2a 7.9±0.6a 213.3±48.3a 117.6±6.4a 28.3±1.4a西格列汀+照射組（n=5） 11.0±0.4ab 3.9±0.3ab 7.4±0.7a 362.0±66.7a 110.0±10.4a 26.8±2.0a組別 骨髓有核細(xì)胞（×106個）白細(xì)胞（×109個/L）紅細(xì)胞（×1012個/L）血小板（×109個/L）血紅蛋白（g/L）

2.2 西格列汀對照射后小鼠HSC 和HPC 的影響

由圖1 可見，與對照組相比，照射組小鼠HSC和HPC 的數(shù)量、百分比均顯著減少、降低（均P<0.05），這表明電離輻射對HSC 和HPC 有一定的損傷作用；與照射組相比，西格列汀+照射組小鼠HPC 的數(shù)量[（33 724.4±10 594.9）個對（101 637.6±17 240.5）個]、百分比[（5.6±1.0）%對（11.5±3.0）%]均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。以上結(jié)果表明，西格列汀可緩解受照小鼠HPC 和HSC 的損傷，對輻射所致造血功能損傷有一定的治療效果。

圖1 西格列汀對7 Gy γ 射線全身照射后小鼠HPC 和HSC 百分比及數(shù)量的影響 a 表示與對照組比較，t=3.174～5.287，均P<0.05；b 表示與照射組比較，t=4.163、5.951，均P<0.05。HPC 為造血祖細(xì)胞；HSC 為造血干細(xì)胞Figure 1 Effect of sitagliptin on the percentage and number of hematopoietic progenitor cells and hematopoietic stem cells of mice exposed to 7 Gy γ-ray whole-body irradiation

2.3 西格列汀對照射后小鼠骨髓細(xì)胞增殖功能的影響

與對照組相比，照射組、西格列汀+照射組小鼠骨髓細(xì)胞CFU-GM 均顯著減少，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.240、9.436，均P<0.05）；與照射組相比，西格列汀+照射組小鼠骨髓細(xì)胞CFU-GM 增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.964，P<0.05）（CFUGM：對照組66.2±5.3、照射組30.8±3.9、西格列汀+照射組38.2±4.4）。以上結(jié)果表明，西格列汀治療可提高7 Gy 照射小鼠骨髓細(xì)胞的克隆形成能力，一定程度上能夠恢復(fù)骨髓細(xì)胞的增殖功能。

2.4 西格列汀對照射后小鼠造血細(xì)胞活性氧水平的影響

由圖2 可見，與對照組相比，照射組小鼠在受照后第30 天HSC 中的活性氧水平顯著升高（P<0.05）；與照射組相比，西格列汀+照射組小鼠HSC 中的活性氧水平顯著降低（P<0.05）（HSC 中的活性氧水平：對照組1980.6±309.3、照射組3994.5±1119.0、西格列汀+照射組2415.7±122.9）。這些結(jié)果提示西格列汀對電離輻射所致的造血系統(tǒng)輻射損傷的保護(hù)作用可能是通過降低HSC 中活性氧水平實現(xiàn)的。

圖2 西格列汀對7 Gy γ 射線全身照射后小鼠BMNC、HPC 和HSC 中活性氧水平的影響 a 表示與對照組比較，t=3.904，P<0.05；b 表示與照射組比較，t=2.375，P<0.05。BMNC 為骨髓有核細(xì)胞；MFI 為平均熒光強(qiáng)度；HPC 為造血祖細(xì)胞；HSC 為造血干細(xì)胞Figure 2 Effect of sitagliptin on the levels of reactive oxygen species in bone marrow nucleated cell, hematopoietic progenitor cell and hematopoietic stem cell of mice exposed to 7 Gy γ-ray whole-body irradiation

3 討論

輻射防護(hù)“老藥”的藥代動力學(xué)及安全性資料已知，其新用途的開發(fā)可以大大節(jié)約研發(fā)周期和成本，被認(rèn)為是新藥開發(fā)中最有效、最快捷的策略之一[11]。西格列汀可抑制腸促胰島激素（如胰高血糖素樣肽-1）和葡萄糖依賴性促胰島素多肽的降解，進(jìn)而治療糖尿病。近年來，有研究者發(fā)現(xiàn)西格列汀還具有抗氧化和消炎的作用，在動脈粥樣硬化、炎癥性腸病、心力衰竭和血管炎癥等疾病中起作用[5,12-13]。提前給予小鼠西格列汀，結(jié)果證實西格列汀可增強(qiáng)輻射暴露后機(jī)體的造血能力恢復(fù)[10]。而本研究在前期觀察西格列汀對正常小鼠血象無顯著影響的基礎(chǔ)上，在小鼠接受7 Gy 照射后給予西格列汀，以觀察西格列汀對造血系統(tǒng)輻射損傷的治療作用，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

我們前期利用C57/BL6 小鼠研究不同劑量137Cs γ 射線照射對HSC 和HPC 的影響，發(fā)現(xiàn)小鼠血細(xì)胞、HSC、HPC 數(shù)量隨照射劑量的增加而降低[14]；本課題組前期觀察了西格列汀對4 Gy 輻射損傷的治療作用[15]，本研究觀察了西格列汀對7 Gy 亞致死劑量輻射損傷小鼠的治療效果。造血系統(tǒng)對輻射高度敏感[16-17]，成年個體造血功能主要由骨髓承擔(dān)，BMNC 數(shù)量可在一定程度上反映骨髓造血能力[18-19]。本研究結(jié)果表明，西格列汀可顯著提高7 Gy受照小鼠的骨髓細(xì)胞和外周血WBC，這提示西格列汀對造血系統(tǒng)輻射損傷具有治療作用。造血系統(tǒng)輻射損傷后發(fā)生功能障礙的原因之一是維持造血功能的HSC 和HPC 受到損傷。HSC 是一類具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，電離輻射可以引起HSC 損傷，導(dǎo)致其數(shù)量減少，自我更新能力降低，導(dǎo)致骨髓的長期損傷[20-21]。在本研究中，我們使用流式細(xì)胞儀觀察了HSC 和HPC 數(shù)量的變化，結(jié)果表明，西格列汀可顯著增加受照小鼠中HPC和HSC 的數(shù)量；進(jìn)一步采用克隆集落形成實驗評估骨髓細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果表明西格列汀還可以促進(jìn)造血細(xì)胞增殖能力的恢復(fù)。以上結(jié)果提示，西格列汀能有效治療造血系統(tǒng)因輻射引起的損傷。

輻射引起的氧化應(yīng)激是輻射損傷的重要原因。電離輻射會直接作用于水分子使其分解，導(dǎo)致大量細(xì)胞源性自由基的產(chǎn)生，過量的活性氧可引起生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 的氧化，造成生物膜損傷，從而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。我們在之前的實驗中發(fā)現(xiàn)小鼠BMNC、HPC 和HSC 在接受6.5 Gy 照射后細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平均有先升高后降低的趨勢，在第28～56 天，HSC 的活性氧水平仍很高，HPC 和BMNC 的活性氧水平已經(jīng)恢復(fù)正常[16]。在本研究中，我們觀察了接受7 Gy 照射后第30 天的小鼠BMNC、HPC 和HSC 中活性氧水平，發(fā)現(xiàn)HSC 中活性氧水平顯著提升，而在其他兩種細(xì)胞中不明顯，這與前期的研究結(jié)果一致。而本研究結(jié)果顯示，西格列汀治療可降低受照小鼠HSC 中活性氧水平，這提示西格列汀可通過調(diào)節(jié)HSC 中活性氧水平來達(dá)到治療造血系統(tǒng)輻射損傷的效果。

總之，本研究結(jié)果表明，西格列汀對造血系統(tǒng)輻射損傷具有治療作用，可能主要是通過降低造血細(xì)胞活性氧水平來實現(xiàn)的。然而，其輻射防護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制和最佳用法、用量等仍有待進(jìn)一步探究。同時，積極開發(fā)輻射防護(hù)“老藥”的新用途，為探索治療電離輻射損傷作用的高效途徑和開展對抗輻射的研究具有重要意義。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明 張遠(yuǎn)洋、王梅芳負(fù)責(zé)現(xiàn)場的取材及實驗、數(shù)據(jù)的收集及整理、論文的撰寫；董銀萍、吳靜負(fù)責(zé)實驗方法的建立；王欣悅、李文璇負(fù)責(zé)現(xiàn)場的取材及實驗；李德冠負(fù)責(zé)實驗的設(shè)計與實施、論文的審閱。