田春花,張 嬌,楊梅芳,楊威龍,吳 陽(yáng),金 秋,馬鴻云

子宮內(nèi)膜癌(EC)是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性惡性腫瘤首位，近年來(lái)發(fā)病率、死亡率呈逐年遞增且年輕化趨勢(shì)[1]，其中有14%左右子宮內(nèi)膜癌患者是育齡女性[2]，這部分人群中約70%仍未生育[3]。以孕激素為基礎(chǔ)的保守治療為這些年輕患者保留生育能力提供了臨床選擇[4]。然而，孕激素治療的完全緩解率(CR)僅70%左右，仍有約30%的患者對(duì)孕激素治療不敏感[5],這給有生育要求的早期子宮內(nèi)膜癌患者的治療帶來(lái)困難，究其原因可能與PR 表達(dá)水平下降、功能異常以及相關(guān)基因突變、信號(hào)通路異常等有關(guān)[6]。孕激素抵抗機(jī)制的靶向治療可能逆轉(zhuǎn)孕激素抵抗，孕激素聯(lián)合靶向治療可能成為早期且有生育要求子宮內(nèi)膜癌保守治療的新手段。有研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者中存在多種 mi-RNA的異常表達(dá)，這說(shuō)明 mi-RNA 參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展[7-8],同時(shí)Lai 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)miR-21具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的作用。本實(shí)驗(yàn)在人工合成高效孕激素作用下，研究拮抗miR-21對(duì)子宮內(nèi)膜癌 Ishikawa 細(xì)胞的增殖與凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料:人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系 Ishikawa(BNCC338359，北納生物)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器:完全DMEM培養(yǎng)基(KGM12800S-500，凱基生物)；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(L3000015，invitrogenTM)；miR-21拮抗劑(中洪博元分子實(shí)驗(yàn)室提供)；人工合成高效孕激素(左炔諾孕：LNG)(S1727)；倒置熒光顯微鏡(MF53，廣州市明美光電有限公司)；多功能酶標(biāo)分析儀(SAFIREII，TECAN)；離心機(jī)(TD4A，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1600PC，上海美譜達(dá)儀器有限公司)；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Chemi DocTM XRS+，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CCK8檢測(cè):將人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)、鋪96孔板(細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔)，待子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞貼壁后，按照分組進(jìn)行相應(yīng)處理，處理24 h向待測(cè)板中每孔加入10 μl CCK-8(KGA317，凱基生物)反應(yīng)2 h，分別采用酶標(biāo)儀(SAFIREII TECAN)在波長(zhǎng)450 nm處檢吸光值并計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.3.2 細(xì)胞劃線:待子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞鋪板密度達(dá)到90%以上后進(jìn)行細(xì)胞劃線，使用200 μl槍頭(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)在每孔進(jìn)行劃痕，棄去培養(yǎng)基，用PBS(KGB5001凱基生物)清洗3次，換成無(wú)血清培養(yǎng)基后給每孔劃痕拍照；將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中，24 h后再次給每孔的劃痕拍照；48 h后再次給每孔的劃痕拍照。測(cè)量細(xì)胞劃痕寬度，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞的遷移速率。

1.3.3 細(xì)胞侵襲:將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞消化收集后離心，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并且計(jì)數(shù)，使每個(gè)小室細(xì)胞數(shù)為3×104個(gè)；在小室加入500 μl完全培養(yǎng)基，上室細(xì)胞與無(wú)血清培養(yǎng)基總體積約300 μl；48 h后進(jìn)行結(jié)晶紫(G1061，Solarbio)染色。去除各孔中的培養(yǎng)基，然后加入PBS(KGB5001 凱基生物)清洗5 min,加配好的0.1%結(jié)晶紫染色1 h,染完后擦去小室的內(nèi)室細(xì)胞，之后將小室倒置拍照,拍照完成后去除孔中的染色液，在每個(gè)孔中加入配制好的33%乙酸(取33 mL 100%乙酸加到67 mL純水中混勻)2 mL溶解細(xì)胞中的染液，充分混勻靜置后，用分光光度計(jì)(波長(zhǎng)為570 nm)，用33%乙酸調(diào)零，測(cè)定每孔中的溶液的吸光值，平行三次。

1.3.4 流式檢測(cè)凋亡:在使用流式細(xì)胞前,首先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。棄子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株上清液，每孔1 mL PBS(KGB5001 凱基生物)潤(rùn)洗2邊，加200 μl含EDTA胰蛋白酶消化液(T1300 Solarbio)，放入37℃培養(yǎng)箱(型號(hào)：BPN-80CM，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，當(dāng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞消化后，用含血清的完全培養(yǎng)基終止子宮內(nèi)膜細(xì)胞消化、吹散后收集子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞懸液。將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞懸液在2 500 r/min離心(常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司，型號(hào)：TGL-16D)3 min并棄上清液。加1 mL PBS(KGB5001 凱基生物)后再2 500 r/min離心3 min后棄去子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞上清液，每管加PBS 300 μl混勻后再加入 5 μl Annexin V-FITC(AP101-100-kit，MULTI SCIENCES 聯(lián)科生物) 和 5 μl PI，輕混勻后，待室溫避光孵育10 min后上機(jī)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組:空白細(xì)胞組為未經(jīng)任何處理的 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞；高效孕激素組為經(jīng)人工合成高效孕激素處理的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞；高效孕激素+miR-21組為經(jīng)人工合成高效孕激素聯(lián)合miR-21拮抗劑處理的子宮內(nèi)膜 Ishikawa 細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 各組干預(yù)前、后Ishikawa細(xì)胞增殖情況的變化： 干預(yù)前與干預(yù)24 h后高效孕激素組細(xì)胞增殖率、高效孕激素+miR-21組細(xì)胞增殖率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后，高效孕激素+miR-21組細(xì)胞增殖率最低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組干預(yù)前、后細(xì)胞增殖情況的比較

2.2 各組干預(yù)前、后Ishikawa細(xì)胞遷移情況的變化：干預(yù)前與干預(yù)24 h后高效孕激素組細(xì)胞遷移率、高效孕激素+miR-21組細(xì)胞遷移率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后，高效孕激素+miR-21組細(xì)胞遷移率最低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組干預(yù)前、后細(xì)胞遷移情況的比較

2.3 各組干預(yù)前、后Ishikawa細(xì)胞侵襲情況的變化：干預(yù)前與干預(yù)24h高效孕激素組細(xì)胞侵襲力、高效孕激素+miR-21組細(xì)胞侵襲力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高效孕激素+miR-21組細(xì)胞侵襲力最低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組干預(yù)前、后細(xì)胞侵襲情況的比較

2.4 各組干預(yù)前、后Ishikawa細(xì)胞凋亡情況的變化：干預(yù)前與干預(yù)24 h后高效孕激素組細(xì)胞凋亡率、高效孕激素+miR-21組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后高效孕激素+miR-21組細(xì)胞凋亡率最高(P<0.05)，見(jiàn)表4

表4 各組干預(yù)前、后細(xì)胞凋亡情況的比較

3 討論

單獨(dú)應(yīng)用孕激素或聯(lián)合宮腔鏡病灶切除是年輕早期子宮內(nèi)膜癌患者最常用、最有效保留生育能力的治療方式[1,10-12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞經(jīng)人工合成高效孕激素處理24 h后，其增殖率、遷移力及侵襲力降低(P<0.05)，凋亡率增高(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)人工合成高效孕激素對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞的抑制作用，為人工合成高效孕激素用于早期子宮內(nèi)膜癌患者保留生育功能治療提供了理論依據(jù)。

雖然孕激素治療早期子宮內(nèi)膜癌的效果已得到肯定，但仍有約30%的患者對(duì)孕激素治療不敏感或無(wú)反應(yīng)，這給年輕患者保留生育功能治療帶來(lái)巨大困難。針對(duì)孕激素抵抗機(jī)制的靶向治療可能逆轉(zhuǎn)孕激素抵抗，應(yīng)用孕激素聯(lián)合靶向治療可能成為有生育要求的子宮內(nèi)膜癌患者治療的新手段。

微小RNA(miRNA)屬于內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它以互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因的3′UTR區(qū)結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA的翻譯，并在轉(zhuǎn)錄后負(fù)責(zé)調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中存在多種微小RNA表達(dá)異常，這預(yù)示著miRNA參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。近年來(lái)的研究表明，miRNA與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制和孕激素受體的表達(dá)[14]。miR-21在多種腫瘤中高表達(dá)[15]，大量研究證實(shí)，多發(fā)性腫瘤抑制基因mRNA的3′非編碼區(qū)含有miR-21特異性識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)[16]。在子宮內(nèi)膜癌患者血清、癌組織中均見(jiàn)miR-21高表達(dá)，且其表達(dá)的程度與淋巴轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后密切相關(guān)[9]，這提示miR-21可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。秦曉燕[17]等的研究證實(shí)了上述觀點(diǎn)。這為臨床子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供了依據(jù)。本研究顯示,在人工合成高效孕激素作用下，聯(lián)合使用miR-21 拮抗劑，子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖率、遷移和侵襲能力較聯(lián)合處理前降低(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率較聯(lián)合處理前升高(P<0.05)。這說(shuō)明聯(lián)合使用人工合成高效孕激素和miR-21拮抗劑可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)增殖，促進(jìn)凋亡。此外，本研究還表明，與空白組及高效孕激素相比，高效孕激素+miR-21組的Ishikawa 細(xì)胞增殖率、遷移力及侵襲力最低，而凋亡率最高，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說(shuō)明在使用人工合成高效孕激素的作用下，拮抗miR-21可以增加抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡的作用，提示人工合成高效孕激素與miR-21拮抗劑可能存在協(xié)同抗癌效應(yīng)。