胡小東，周 春 ,康向飛，李文峰

有機(jī)磷中毒是全球最重要的急性中毒公共衛(wèi)生事件，我國也是有機(jī)磷中毒高發(fā)國家之一[1]。目前，雖然相關(guān)解毒劑和血液灌流等治療措施應(yīng)用可以有效挽救患者生命，但是嚴(yán)重有機(jī)磷中毒患者死亡率依然很高[2]。在嚴(yán)重有機(jī)磷中毒中肝臟是主要損傷器官之一，也是導(dǎo)致死亡的主要原因，因此探索肝保護(hù)解毒藥物能夠為治療有機(jī)磷中毒提供有效手段[3]。脂肪乳作為一種靜脈注射制劑已經(jīng)成為預(yù)防、治療局麻藥中毒的首選用藥[4]。有研究發(fā)現(xiàn)脂肪乳劑對有機(jī)磷中毒肝損傷具有一定的保護(hù)作用，但是其具體作用機(jī)制還不明確，因此，本研究擬評價20%脂肪乳劑對有機(jī)磷中毒肝損傷的治療作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2019年3月-2020年5月選擇由寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心人工培育的供實(shí)驗用Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重為200～240 g。實(shí)驗前大鼠在動物室內(nèi)自由飲食飲水，光照12 h，明暗交替，保持室溫22～26 ℃，濕度50%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗前隔夜禁食。

1.2 模型制備:將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(玉米油+0.9%生理鹽水)、模型組(馬拉硫磷+0.9%生理鹽水)和治療組(馬拉硫磷+20%脂肪乳)，每組20只大鼠。模型組和治療組通過灌胃途徑給予100 mg/kg馬拉硫磷(基于LD50和體重計算馬拉硫磷的劑量，雄性Wistar大鼠的LD50為1 768～1 857 mg/kg)。同時對照組通過灌胃途徑給予同體積的玉米油。

1.3 藥物治療:馬拉硫磷灌胃10 min后，治療組通過尾靜脈給予3 mL/kg的20%脂肪乳；同時對照組和模型組通過尾靜脈給予3 mL/kg的生理鹽水。實(shí)驗執(zhí)行期間所有實(shí)驗動物均正常飲水飲食。

1.4 組織取材:給藥后12 h進(jìn)行組織取材。腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉動物，迅速經(jīng)腹主動脈采血，所有血液均置于肝素抗凝采血管中，血樣經(jīng)3 500 r/min離心5 min，收集上清血漿按整體積分裝于凍存管中，血漿樣本經(jīng)液氮迅速冷凍后儲存于-80 ℃冰箱中待檢。之后動物在麻醉下死于失血，取出肝臟，冷卻的生理鹽水洗滌，在濾紙上吸干多余水分和血液，稱取整體肝臟并將其立即切成兩半，一半固定在4%多聚甲醛中，另一半經(jīng)液氮迅速冷凍后儲存于-80 ℃冰箱中待檢。

1.5 檢測指標(biāo):采用邁瑞全自動化學(xué)發(fā)光測定儀CL-900i全自動免疫分析儀及其配套試劑盒檢測血清樣本ALT和AST表達(dá)水平，將-80 ℃冰箱保存的肝組織研磨、裂解、離心后提取上清液進(jìn)行肝組織MDA、SOD和GSH表達(dá)水平檢測(采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測，試劑盒購于上?？道噬锟萍加邢薰?，所有檢測嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒操作指南進(jìn)行。取肝臟左葉組織，按照HE染色操作步驟進(jìn)行組織處理后，光鏡下觀察肝臟病理改變。采用Western blot方法觀察肝臟組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。將-80℃冰箱保存肝組織經(jīng)研磨、裂解、離心后提取總蛋白，12 000 r離心20 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。按5份樣品體積與1份loading buffer混勻，100 ℃ 孵育3 min，上樣體積為10～20 μl，經(jīng)5%～12%SDS-PAGE分離樣品后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，按操作加入相應(yīng)的一抗(GAPDH抗體1∶800、Bcl-2抗體1∶1 000、Bax抗體1∶1 000、Caspase-3抗體1∶1 000)及適當(dāng)稀釋倍數(shù)的二抗。凝膠成像系統(tǒng)攝相分析。以GAPDH作為內(nèi)參，用靶蛋白積分吸光度(IA)值/GAPDH(IA)值顯示靶蛋白相對水平。所有抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生化指標(biāo)比較:大鼠肝組織中GSH、CAT和SOD表達(dá)水平治療組與模型組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組MDA水平與模型組相比顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);治療組大鼠血清ALT和AST表達(dá)水平與模型組相比也明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)改變情況:模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)竇狀擴(kuò)張，并發(fā)生球囊變性。實(shí)質(zhì)內(nèi)也有局灶性單核細(xì)胞聚集。治療組大鼠肝細(xì)胞損傷減少，肝細(xì)胞有規(guī)律地排列在血竇旁，見圖1-圖3(封二)。

2.3 各組大鼠Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)與GAPDH比值情況:治療組大鼠肝組織中Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)與模型組相比明顯減少，而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2和圖4(封二)。

表2 各組大鼠Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)與GAPDH比值情況

3 討論

脂肪乳對有機(jī)磷農(nóng)藥肝損傷保護(hù)作用。有機(jī)磷農(nóng)藥主要在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化代謝，當(dāng)超過肝的解毒能力范圍時，就會對肝臟線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等重要細(xì)胞器造成影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂和死亡[5]。有研究表明，有機(jī)磷化合物可誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體功能衰竭，進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞凋亡，加重了肝損傷[6]。同時有機(jī)磷農(nóng)藥增加了肝細(xì)胞中Caspase-1、Caspase-3和p53基因的表達(dá)水平，并在門靜脈區(qū)域觀察到組織病理學(xué)上淤血和壞死的改變[7]。在對有機(jī)磷農(nóng)藥暴露者的研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷農(nóng)藥中毒者的膽堿酯酶和抗氧化劑(GSH)水平降低，而MDA和Caspase-3活性增加[8]。

我們的研究中發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷可以使大鼠肝組織中GSH和SOD酶活性降低，而MDA酶活性升高。同時凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減少。這進(jìn)一步表明有機(jī)磷農(nóng)藥中毒肝損傷可能與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們給予脂肪乳劑治療后可以使GSH和SOD酶活性表達(dá)明顯升高，同時降低MDA酶活性(P<0.05)。脂肪乳劑治療后降低了大鼠肝組織中凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)，升高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá) (P<0.05)。有機(jī)磷農(nóng)藥增加肝臟組織的氧化應(yīng)激，通過激活細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑，極有可能導(dǎo)致Bax和Caspase3免疫反應(yīng)活性的增加。除氧化損傷外，通過抑制線粒體呼吸復(fù)合物，有機(jī)磷農(nóng)藥也可能是觸發(fā)細(xì)胞凋亡的一個額外的內(nèi)在因素[9]。對有機(jī)磷農(nóng)藥中毒大鼠來說，脂肪乳劑除作為一種能量來源外，還可以通過進(jìn)一步抗氧化和抗凋亡作用提供一種新的保護(hù)機(jī)制，組織病理學(xué)改變也表明脂肪乳劑能改善有機(jī)磷農(nóng)藥對肝組織的損傷程度。

在脂肪乳劑關(guān)于局麻藥物解毒的研究中，其主要作用機(jī)制被認(rèn)為是通過脂肪吸附效應(yīng)，將有毒物質(zhì)從機(jī)體中分離，從而降低毒性損傷發(fā)揮作用[10]。同時也有學(xué)說認(rèn)為脂肪乳劑改善線粒體代謝，增加線粒體內(nèi)脂肪酸的濃度，恢復(fù)細(xì)胞的能量供應(yīng)，增加ATP合成也可能是脂肪乳劑解毒的作用機(jī)制[11]。關(guān)于脂肪乳劑治療有機(jī)磷中毒的臨床研究表明，脂肪乳劑對有機(jī)磷中毒患者的治療是安全的，無血流動力學(xué)參數(shù)變化及不良反應(yīng)發(fā)生[12]。一項脂肪乳劑對有機(jī)磷中毒患者的療效及預(yù)后薈萃分析也表明，脂肪乳劑有助于改善有機(jī)磷中毒患者的預(yù)后和肝功能[13]。急性有機(jī)磷中毒救治的專家共識雖然沒有明確推薦脂肪乳劑用于有機(jī)磷農(nóng)藥中毒治療[1]，但是目前普遍認(rèn)為其可能是一種有效的治療手段，只是缺乏足夠的臨床證據(jù)支撐。在我們的研究中，通過馬拉硫磷制備有機(jī)磷中毒大鼠模型，給予脂肪乳劑后可以顯著逆轉(zhuǎn)肝臟組織的組織學(xué)損傷。此外，我們發(fā)現(xiàn)脂肪乳劑治療后細(xì)胞凋亡減少，這可能是脂肪乳劑與馬拉硫磷結(jié)合降低了循環(huán)中馬拉硫磷的游離水平，同時改善了肝臟線粒體代謝，減少了氧化應(yīng)激和炎癥損傷。

綜上所述，脂肪乳劑對有機(jī)磷農(nóng)藥中毒肝損傷具有治療作用,其作用機(jī)制可能與脂肪乳劑與馬拉硫磷結(jié)合后阻止其進(jìn)入肝臟實(shí)質(zhì)中，從而抑制了細(xì)胞凋亡活動，減少了馬拉硫磷的代謝量有關(guān)。除脂肪吸附理論外，脂肪乳劑還可能通過減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)刺激保護(hù)線粒體等重要細(xì)胞器，為細(xì)胞產(chǎn)生大量能量。為了進(jìn)一步探討脂肪乳劑在機(jī)體內(nèi)與有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)合的多少，還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。