鄭軍榮，羅立津*，樂占線，劉建津，聶毅磊，賈緯，莊鴻

(1.福建省微生物研究所，福州 350007；2.福建清道夫環(huán)?？萍加邢薰?，福州 350004)

0 引言

近年來，中國(guó)蛋雞養(yǎng)殖業(yè)得到飛速發(fā)展，集約化程度不斷提高，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。由此也帶來了雞糞大量堆積問題，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖場(chǎng)周邊的生態(tài)環(huán)境。而蛋雞糞含有豐富的作物生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)養(yǎng)分，但直接用作肥料會(huì)造成植物燒根死亡，并且其中的寄生蟲、病毒和病菌，給生態(tài)環(huán)境造成巨大的危害[1]。目前，堆肥是無害化、資源化處理雞糞的最有效方法之一，在減輕環(huán)境污染的同時(shí)可最大程度地實(shí)現(xiàn)資源化利用[2-3]。傳統(tǒng)的高溫堆悶發(fā)酵方法處理雞糞，由于初期的微生物數(shù)量少，發(fā)酵周期長(zhǎng)且腐熟程度低、惡臭氣體仍很嚴(yán)重。堆肥反應(yīng)器由于占地面積小，處理周期短，臭味得到有效控制，是當(dāng)前大型畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便資源化利用較為理想的好氧堆肥模式。目前，在堆肥反應(yīng)器中利用微生物對(duì)雞糞進(jìn)行快速無害化處理是研究熱點(diǎn)，學(xué)者已從不同來源的有機(jī)物料中，有針對(duì)性地分離了大量的菌株用于雞糞的腐熟研究工作，且取得了一定的成果[4-6]。研究表明，接種有效的外源高溫功能微生物進(jìn)行雞糞堆肥，不僅能夠促進(jìn)雞糞堆肥的快速升溫，有效地縮短腐熟周期，去除腐熟過程中產(chǎn)生的臭氣，提高堆肥質(zhì)量的效果[7-9]。但是，不同品種的雞糞微生物菌群結(jié)構(gòu)和特性并不相同，能發(fā)揮效能的菌株不僅與地域種類有關(guān)，而且不同的品種有一定的相關(guān)性[10]。因此，現(xiàn)有的雞糞腐熟菌劑產(chǎn)品在實(shí)際推廣應(yīng)用中仍存在菌株的適應(yīng)性差、作用單一、升溫慢、腐熟周期長(zhǎng)、臭氣較重的問題。從雞糞中分離的活性菌株，能夠有效解決適應(yīng)性問題并迅速成為優(yōu)勢(shì)菌，且通過多株不同代謝能力的菌株組合的協(xié)同發(fā)酵，完成單個(gè)菌株難以完成的復(fù)雜代謝作用，從而對(duì)雞糞的有效轉(zhuǎn)化[11]。

本研究利用LB培養(yǎng)基對(duì)雞糞堆肥的高溫微生物菌群進(jìn)行分離、鑒定，并通過考察菌株對(duì)淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素的降解能力及抗菌活性，獲得3～4株不同腐熟功能和抗菌活性的菌株，并制成復(fù)合菌劑，在小型堆肥反應(yīng)器中用于雞糞發(fā)酵腐熟除臭效果實(shí)驗(yàn)研究，為今后在蛋雞糞堆肥反應(yīng)器發(fā)酵中大規(guī)模推廣提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雞糞堆肥樣品采集于福建省大豐山禽業(yè)發(fā)展有限公司的蛋雞養(yǎng)殖基地。病原菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和沙門氏菌(Samonella)由環(huán)境微生物研究室保存。Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)于上海生物工程股份有限公司。PCR及測(cè)序引物(16S rRNA基因正向引物27F和反向引物1492R)由海生物工程股份有限公司合成。LB培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋公司。培養(yǎng)基如下：

1)淀粉水解培養(yǎng)基：可溶性淀粉0.2%， 蛋白胨1%， 酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH 7.0～7.2。

2)蛋白質(zhì)降解培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5% ，瓊脂2%，pH 7.0～7.2，脫脂奶粉1%(分開滅菌消后添加)。

3)纖維素降解培養(yǎng)基：酵母浸出粉0.05%，酸水解酪蛋白0.05%， KH2PO40.09%，MgSO4·7H2O 0.05%，羧甲基纖維素鈉0.5%，瓊脂2%，pH 7.0±0.1，剛果紅0.02%。

1.2 方法

1.2.1 雞糞堆肥中的微生物分離及純化

將腐熟不同時(shí)間的樣品，用稀釋涂布的方法分離到Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基上并在50℃下培養(yǎng)2～3天，挑取單菌落進(jìn)行劃線分離純化。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)和分子生物鑒定

純化單菌落分別接種到LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。挑取菌落用革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，并根據(jù)菌株的菌落形態(tài)和顯微鏡下特征進(jìn)行初步分類。

采用細(xì)菌DNA試劑盒提取DNA，采用文獻(xiàn)[10]的方法PCR擴(kuò)增16S rRNA基因序列(引物27F為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R為5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，獲得的DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定(委托尚亞生物完成)。將獲得的菌株16S rRNA基因序列在Ezbiocloud中比對(duì)，確定同源性很高的種屬，隨后將所得序列與初步確定種的模式菌株序列運(yùn)用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)一步確定最接近的種屬。

1.2.3 菌株對(duì)淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素降解能力的測(cè)定

將菌株點(diǎn)樣在淀粉水解培養(yǎng)基、蛋白質(zhì)降解培養(yǎng)基和纖維素降解培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h或更長(zhǎng)的時(shí)間，觀察菌落周圍是否有水解透明圈并測(cè)透明圈的大小，確定不同菌株對(duì)淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素的降解能力。

1.2.4 菌株的抗菌活性

將分離的活性菌株或病原菌，分別用肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，菌株生長(zhǎng)良好。取病原菌0.1 mL涂布于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，隨后將滴加了10 μL分離菌菌液的無菌小圓形濾紙貼于其上，培養(yǎng)48 h左右觀察抑菌情況。

1.2.5 室內(nèi)模擬堆肥

選擇具有解淀粉、降解蛋白質(zhì)、降解纖維素或抑菌效果的菌株用液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩富集培養(yǎng)24 h，離心獲取菌體進(jìn)行冷凍干燥，取凍干菌渣與麩皮混合制成活菌總數(shù)達(dá)108cfu/g的復(fù)合菌劑。

將3份雞糞與1份輔料(食用菌廢棄菌糠)裝入20 L不銹鋼發(fā)酵桶中，調(diào)節(jié)水分含量在60%左右，接入5%的108cfu/g的復(fù)合菌劑，攪拌均勻，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵8天，每24 h翻動(dòng)堆料一次，并在堆制過程中觀察發(fā)酵的溫度、狀態(tài)及氣味等變化的差異，以不接種菌劑為對(duì)照。

1.2.6 指標(biāo)測(cè)定和數(shù)據(jù)分析

每天翻堆之前記錄多點(diǎn)的溫度。樣品中的水分、pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀的測(cè)定參考《NY 525-2012 有機(jī)肥料》的方法[12]。大腸桿菌采用大腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行[13]。寄生蟲卵計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法進(jìn)行[14]。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異顯著。

表 1 分離菌株的部分形態(tài)特征 Table 1 Morphological characteristics of isolated strains

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

用LB培養(yǎng)基對(duì)雞糞堆肥微生物在50℃條件下進(jìn)行分離篩選，獲得一系列不同菌落形態(tài)的菌株。經(jīng)多次純化后，獲得YJFJ4、YJFJ6、YJFJ8、YJFJ9和YJFJ12這5株菌，大部分菌落表面干燥、不透明、邊緣不整齊，G+，有芽孢。通過菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察可以確定，它們大部分為G+的芽孢桿菌(表1)。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)5株芽孢菌提取DNA、擴(kuò)增16S rRNA基因序列、經(jīng)測(cè)序后在Ezbiocloud中分析，結(jié)果擴(kuò)增的DNA片段都在1 500 bp左右，每株都有幾個(gè)與其同源性在99%以上的種。其中YJFJ4與特基拉斯芽孢桿菌(Bacillustequilensis)KCTC 13622(AYTO01000043)的相似性最高為99.86 %；YJFJ6與副地衣芽孢桿菌(B.paralicheniformis) KJ-16(KY694465)的相似性最高為99.76%；YJFJ8與暹羅芽孢桿菌(B.siamensis) KCTC13613(AJVF01000043)的相似性最高為99.72 %；YJFJ9與地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)ATCC 14580(AE017333)的相似性最高為99.65%；YJFJ12與枯草芽孢桿菌糞便亞種(B.subtilissubsp.stercoris)D7XPN1 (JHCA01000027)的相似性最高為99.84 %(表2)。利用5株菌及最相似種的模式菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，YJFJ4與特基拉斯芽孢桿菌KCTC 13622的進(jìn)化距離近，YJFJ6與副地衣芽孢桿菌KJ-16的進(jìn)化距離最近，YJFJ8與暹羅芽孢桿菌KCTC13613的進(jìn)化距離最近，YJFJ9與地衣芽孢桿菌ATCC 14580的進(jìn)化距離最近，YJFJ12與枯草芽孢桿菌糞便亞種D7XPN1的進(jìn)化距離近(圖1)。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)可以初步確定菌株YJFJ4與特基拉斯芽孢桿菌KCTC 13622為同一種；YJFJ6與副地衣芽孢桿菌KJ-16為同一種；YJFJ8與暹羅芽孢桿菌KCTC13613為同一種；YJFJ9-3與地衣芽孢桿菌ATCC 14580為同一種；YJFJ12與枯草芽孢桿菌糞便亞種D7XPN1為同一種。

圖 1 5株菌的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 The phylogenetic tree of 16S rRNA of 5 strains

注：CK為對(duì)照，下同。

圖 3 菌株對(duì)雞糞發(fā)酵過程中pH的影響Figure 3 Effects of strains on pH of chicken manure during fermentation

圖 4 菌株對(duì)雞糞發(fā)酵過程中含水率的影響Figure 4 Effects of strains on water content of chicken manure during fermentation

表 2 5株菌的16S rRNA測(cè)序結(jié)果比較Table 2 Comparative results of 16S rRNA sequencing of 5 strains

表 3 活性菌株對(duì)淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素的降解結(jié)果 Table 3 The degradation results of starch, protein and cellulose of 5 strains

表 4 活性菌株對(duì)不同病原菌的抑制效果 Table 4 Inhibitory effect of 5 strains on different pathogenic bacteria

2.3 菌株對(duì)淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素的降解

對(duì)菌株進(jìn)行淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素的降解試驗(yàn)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明,YJFJ4、YJFJ6、YJFJ8、YJFJ9和YJFJ12對(duì)淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素有不同程度的降解能力。YJFJ8降解淀粉和蛋白質(zhì)能力接近且最好，但是降解纖維素能力最差。YJFJ4降解淀粉和蛋白質(zhì)的能力僅次于YJFJ8，但是解淀粉能力優(yōu)于蛋白質(zhì)，降解纖維素的能力略優(yōu)于YJFJ8。YJFJ12解淀粉和蛋白質(zhì)的能力相當(dāng)，解淀粉能力和纖維素能力僅次于YJFJ4。在這些菌株中,YJFJ6和YJFJ9解淀粉和蛋白質(zhì)能力最差，解纖維素能力最好，解淀粉和纖維素能力接近且優(yōu)于解蛋白質(zhì)的能力。可能是由于這些菌株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的能力大小不同，從而造成它們對(duì)降解淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素功能上有明顯的差異。因此，在物質(zhì)組分復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境中，這些菌株共同生長(zhǎng)對(duì)物質(zhì)的降解效果會(huì)明顯優(yōu)于單一的菌株。

2.4 菌株的抗菌特性

對(duì)菌株進(jìn)行抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的試驗(yàn)。結(jié)果顯示，YJFJ4和YJFJ12對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有抑菌圈但是不透明仍有部分生長(zhǎng)，抑菌作用不明顯；YJFJ6和YJFJ9對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌圈但是不透明，仍有部分生長(zhǎng)，而對(duì)沙門氏菌有明顯的透明圈，且抑制作用明顯。YJFJ8對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有明顯的抑制作用而對(duì)大腸桿菌不明顯(表4)。因此，可以確定在低溫條件下，這些菌株對(duì)不同的病原菌抑制能力有一定差異，在病菌多樣化的生態(tài)環(huán)境中共同生長(zhǎng)對(duì)病原菌的抑制效果會(huì)明顯優(yōu)于單一的菌株。

2.5 菌株復(fù)合發(fā)酵對(duì)雞糞堆肥溫度、pH和含水率的影響

利用YJFJ4、YJFJ6、YJFJ8、YJFJ9和YJFJ12在37℃條件下對(duì)雞糞進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵試驗(yàn)，以不加菌發(fā)酵為對(duì)照，測(cè)發(fā)酵8天內(nèi)溫度、pH和含水率，結(jié)果見圖2～4。

溫度是影響微生物活動(dòng)和堆肥發(fā)酵過程的關(guān)鍵因素，溫度的高低決定堆肥進(jìn)程的快慢。從圖2可知，在整個(gè)的發(fā)酵過程中前期快速上升后期緩慢下降。添加菌株發(fā)酵1天堆肥溫度迅速上升到50℃，3天后最高溫達(dá)到57 ℃左右，而對(duì)照發(fā)酵1天堆體溫度緩慢上升到42℃左右，4天后最高溫到50℃左右，添加菌株發(fā)酵溫度上升快而且高，效果顯著。發(fā)酵一定時(shí)間后，微生物生長(zhǎng)活力減弱，溫度開始下降，發(fā)酵8天溫度接近初始溫度，但是整個(gè)過程中，添加菌株發(fā)酵的溫度差異極顯著(P<0.01)，始終高于純雞糞發(fā)酵的對(duì)照組。推測(cè)菌株加入雞糞中后，足夠數(shù)量的菌株利用雞糞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速生長(zhǎng)成為優(yōu)勢(shì)菌，縮短了發(fā)酵的延遲期；同時(shí)菌株生長(zhǎng)釋放大量的熱量，促進(jìn)發(fā)酵溫度的迅速提升；迅速升高的溫度加速了物質(zhì)的分解和雞糞中原有微生物的生長(zhǎng)，迅速分解的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又能夠進(jìn)一步加速微生物的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)雞糞的發(fā)酵降解腐熟更加徹底，縮短發(fā)酵周期。此外，高溫會(huì)使部分微生物的生長(zhǎng)受到抑制，從而引起溫度的下降，而高溫菌的添加能夠延長(zhǎng)堆肥高溫發(fā)酵的時(shí)間，有利于堆肥腐熟的順利進(jìn)行，同時(shí)殺死大部分的致病菌、寄生蟲及其卵。

pH對(duì)微生物的正常生長(zhǎng)發(fā)酵至關(guān)重要，除酵母和霉菌外，大部分的微生物適合生長(zhǎng)的pH范圍為中性微偏堿性。從圖3可知，在整個(gè)堆肥發(fā)酵過程中pH較高，且均為先升后降的變化趨勢(shì)。與對(duì)照相比，添加菌株發(fā)酵后堆肥的pH值均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，且在發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH值下降至7.9，而對(duì)照組的pH值則達(dá)到8.4，結(jié)果表明在雞糞局部的厭氧發(fā)酵條件下，發(fā)酵前期雞糞中的含氮有機(jī)質(zhì)分解產(chǎn)生大量的NH3，促進(jìn)pH值的上升，隨著部分NH3揮發(fā)和硝化菌硝化產(chǎn)生的H+使pH值降低；添加菌株發(fā)酵使雞糞的微生態(tài)菌群結(jié)構(gòu)生變化，從而改變了物質(zhì)消化分解的途徑，減少NH3的產(chǎn)生，抑制pH的快速上升。因此，添加菌株復(fù)合發(fā)酵能夠控制堆肥的pH值，避免pH值過高而不利于微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)控制氨氣的排放。

固態(tài)發(fā)酵中物料的含水率對(duì)微生物生長(zhǎng)有很大的影響，適度的水分含量有利于菌株的生長(zhǎng)，但是水分也影響了氧氣的傳遞。從圖4可知，添加菌株發(fā)酵組和對(duì)照組的含水率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)都下降明顯，但是添加菌株發(fā)酵組的含水率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，且發(fā)酵8天時(shí)，水分揮發(fā)的速率明顯快于對(duì)照組。這說明雞糞添加菌株后，菌株迅速生長(zhǎng)釋放大量的熱量引起水分的迅速揮發(fā)，而水分的迅速減少增加了堆料的通透性，有利于氧氣的傳遞和菌株的進(jìn)一步生長(zhǎng)，從而進(jìn)一步加速溫度的提升和水分的揮發(fā)，促進(jìn)堆體的進(jìn)一步發(fā)酵腐熟。

2.6 菌株復(fù)合發(fā)酵對(duì)雞糞堆肥及臭氣的影響

添加菌株復(fù)合發(fā)酵雞糞8天后，堆體變小，顏色變?yōu)樽睾稚p微臭味，較發(fā)酵前干燥、松散，而對(duì)照組的堆體臭味濃烈、黏稠，添加菌株復(fù)合發(fā)酵效果明顯優(yōu)于對(duì)照組(表5)。推測(cè)菌株加入雞糞后利用雞糞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速繁殖生長(zhǎng)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，雞糞中的大部分物質(zhì)被有效的分解利用，導(dǎo)致堆體體積逐漸變小、變色，大量水分的揮發(fā)使得堆肥更干燥和疏松。此外，迅速生長(zhǎng)的菌株與雞糞中原有的微生物搶奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了腐敗微生物的生長(zhǎng)，阻斷了厭氧條件下蛋白質(zhì)、氨基酸等被消化降解產(chǎn)生的氨氣、硫化氫、甲胺、三甲胺和乙烯醇等難聞氣味物質(zhì)的可能，減少了臭氣的排放。

2.7 菌株復(fù)合發(fā)酵對(duì)雞糞堆肥大腸桿菌和寄生蟲卵的影響

從表6可以看出, 發(fā)酵前雞糞中含有大量的大腸桿菌和寄生蟲卵，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，對(duì)照組和添加菌株發(fā)酵組的大腸桿菌和蟲卵數(shù)量都在逐漸減少。發(fā)酵8天時(shí),添加菌株發(fā)酵組中的大腸桿菌數(shù)下降了3個(gè)數(shù)量級(jí)，為2.35 lg cfu/g，且比對(duì)照組少1個(gè)數(shù)量級(jí)；寄生蟲卵的死亡率達(dá)到83.01%，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果表明，堆溫的控制及菌株的添加對(duì)于殺滅致病菌至關(guān)重要。在發(fā)酵初期外源菌株生長(zhǎng)繁殖對(duì)不同病原菌有協(xié)作抑制作用，發(fā)酵溫度的迅速提高及高溫時(shí)間的延長(zhǎng)能夠更好地殺死病原菌和寄生蟲，提高堆肥的品質(zhì)。

表 5 菌株復(fù)合發(fā)酵雞糞堆肥感官及氣味的變化 Table 5 Changes in sensory and odor of chicken manure fermented by strains

表 6 菌株復(fù)合發(fā)酵雞糞堆肥大腸桿菌和寄生蟲卵的變化 Table 6 Changes of E.coli and parasitic eggs in chicken manure compost fermented by strains

表 7 菌株復(fù)合發(fā)酵雞糞堆肥養(yǎng)分的變化 Table 7 Changes of nutrients in chicken mature compost fermented by strains

2.8 菌株復(fù)合發(fā)酵對(duì)雞糞堆肥養(yǎng)分的影響

對(duì)發(fā)酵8天的雞糞堆肥檢測(cè)其相關(guān)養(yǎng)分指標(biāo)。從表7可以看出, 添加菌株復(fù)合發(fā)酵組的有機(jī)質(zhì)、總鉀和總磷都極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，總氮與對(duì)照組差異不明。結(jié)果表明，添加菌株使雞糞發(fā)酵更完全，從而改變堆肥中的部分養(yǎng)分含量，有利于提高堆肥的品質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

雞糞中不僅含有大量的淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素且含有大量的微生物。雞糞堆肥就是利用雞糞自身的微生物對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵降解，達(dá)到腐熟目的。近年來,學(xué)者對(duì)不同來源的雞糞中的微生物種群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的雞糞微生物組成和種類并不完全相同[15-16]。本實(shí)驗(yàn)組前期也對(duì)來自福建不同養(yǎng)殖場(chǎng)的雞糞堆肥微生物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)雞糞中微生物與雞本身生長(zhǎng)時(shí)期、養(yǎng)殖模式和環(huán)境的變化有很大的相關(guān)性。盡管不同雞糞中的微生物確實(shí)有一定的差異，但是在堆肥高溫期都有各種芽孢桿菌，可能是堆肥中腐熟的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)菌。

雞糞微生物組成復(fù)雜，利用特定的培養(yǎng)條件，能夠迅速地獲得目的菌株，分子生物學(xué)方法能夠?qū)Υ罅康木昕焖勹b定[5]。本實(shí)驗(yàn)采用LB培養(yǎng)基在50℃條件下對(duì)雞糞堆肥中的高溫菌進(jìn)行分離，獲得5株不同形態(tài)的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定后，對(duì)菌株進(jìn)行16S rRNA序列分析，確定它們分別是特基拉斯芽孢桿菌YJFJ4、副地衣芽孢桿菌YJFJ6、暹羅芽孢桿菌YJFJ8、地衣芽孢桿菌YJFJ9和枯草芽孢桿菌糞便亞種YJFJ12。研究表明，部分芽孢桿菌能有效減少雞糞便中氨、硫化氫等臭味氣體的產(chǎn)生[4]。由此可見，盡管這些菌株不是新種，但是不同來源的菌株即使是相同的種也有功能的差異性，有潛在的研究?jī)r(jià)值。分子生物學(xué)對(duì)芽孢桿菌的鑒定有很大的幫助，但是要精確的鑒定還需做大量的工作。

雞糞堆肥發(fā)酵中，微生物起著至關(guān)重要的作用，不同微生物能夠通過協(xié)作，降解淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素等有機(jī)物，來影響發(fā)酵過程中氣體的排放及腐熟的程度[17-18]。楊偉平等[19-20]將具有蛋白質(zhì)、纖維素分解能力的芽孢桿菌用于畜禽糞便的堆肥發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)堆肥不僅能夠快速升溫，同時(shí)糞便中的有機(jī)質(zhì)和粗纖維也被加速降解，氨和硫化氫氣體的釋放也被抑制。本研究得出YJFJ4、YJFJ8和YJFJ12具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)和淀粉降解能力，而YJFJ6和YJFJ9具有較強(qiáng)的纖維素降解能力，對(duì)病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有不同程度的抑制作用。結(jié)果表明，這些菌株的降解功能和抑制作用并不完全相同，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜、惡臭氣體多樣混合的雞糞，復(fù)合使用能夠起到協(xié)同發(fā)酵，減少惡臭氣體排放的效果。將這些菌株添加到雞糞中發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)能夠縮短發(fā)酵的延遲期，提高發(fā)酵溫度和延長(zhǎng)高溫時(shí)間，抑制pH的升高，加速水分的釋放，同時(shí)減少臭氣的產(chǎn)生，促進(jìn)腐熟的完全。若將復(fù)合菌劑加入雞糞后可明顯改變雞糞中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，成為優(yōu)勢(shì)菌群并發(fā)揮相應(yīng)功能，從而達(dá)到提升除臭率的目的。對(duì)堆肥發(fā)酵8天后雞糞中的大腸桿菌、寄生蟲和養(yǎng)分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，菌株的添加可以更好地減少大腸桿菌的數(shù)量，提高寄生蟲的死亡率，及提高堆肥中有機(jī)質(zhì)、總磷和總鉀的含量。結(jié)果表明在發(fā)酵升溫前期，復(fù)合菌株產(chǎn)生的某種物質(zhì)可能對(duì)致病菌的生長(zhǎng)有抑制，同時(shí)病原菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被競(jìng)爭(zhēng)性地爭(zhēng)奪從而抑制病原菌的生長(zhǎng)，加上菌株迅速生長(zhǎng)釋放大量的熱量能夠有效殺死部分的病原菌和寄生蟲，而且溫度越高，效果越明顯。由于腐敗的病原菌生長(zhǎng)被抑制，產(chǎn)生的惡臭物質(zhì)會(huì)相應(yīng)減少。因此，可以確定，將分離自雞糞的高溫菌株的復(fù)合使用于堆肥反應(yīng)器中雞糞發(fā)酵，能夠有效地縮短發(fā)酵延遲期，提高發(fā)酵速度和溫度，協(xié)同發(fā)酵促進(jìn)腐熟的完成，減少臭氣的排放，提高堆肥的品質(zhì)。