黃志偉，劉濤，陳曉波，耿潔，李光，王玉亮△

T細胞共刺激分子OX40（CD134）及其同源配體OX40L（CD134L、CD252）作為治療T 細胞所介導疾病的重要靶點被廣泛研究。OX40、OX40L分別屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體及TNF 超家族的成員，OX40 在活化的 CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、中性粒細胞和自然殺傷細胞中均有表達，OX40L主要表達于活化的抗原提呈細胞（APC）、活化的T/B 細胞及巨噬細胞等。T 細胞與APC 間以及T 細胞相互間均可通過OX40 和OX40L 共刺激信號（第二信號）的傳導而增強T 細胞活化能力、CD4+記憶T 細胞增殖水平及濾泡輔助T 細胞（Tfh）的生成，進而調(diào)節(jié)T 輔助細胞（Th）1 與Th2 的平衡，促進干擾素（IFN）-γ、TNF-α、白細胞介素（IL）-2、IL-21等細胞因子的產(chǎn)生［1-2］。在器官移植和自身免疫性疾病中，阻斷OX40/OX40L共刺激信號可以抑制T細胞活化、延長移植物的存活時間并提高對自身抗原的免疫耐受［3］。脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSCs）因可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、減輕全身炎癥反應及損傷修復等功能而成為治療多種難治性疾病的有效方案［4］。此外，ADSCs作為基因治療載體也具有潛在的臨床應用價值。本研究擬構建OX40Ig基因修飾ADSCs（ADSCsOX40Ig），探討其對異基因反應性淋巴細胞免疫抑制的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SPF 級Lewis 大鼠5 只和BN 大鼠4 只，6～8 周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；胰蛋白酶、成骨成脂及成胰島樣細胞誘導試劑、絲裂霉素C（美國Sigma 公司）；細胞標記抗體、FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD 公司）；MiniBEST 凝膠DNA 回收試劑盒（日本TaKaRa 公司）；TRIzol RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒載體pcDNA3.1（+）、瓊脂糖（美國Invitrogen 公司）；EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶（美國Thermo 公司）；AxyPrep質(zhì)粒小量提取試劑盒（美國Corning公司）；Amaxa轉染試劑盒（德國Amaxa 公司）；重組Anti-OX40 抗體（美國Abcam 公司）；ABI 7500實時熒光PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）。

1.2 大鼠OX40 胞外區(qū)編碼序列的獲得及合成 取雄性Lewis 大鼠1 只，異氟醚吸入麻醉后取腹主動脈新鮮血液2 mL，淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，按耿潔等［5］方法擴增大鼠OX40 胞外區(qū)及人IgG Fc 段編碼序列。OX40片段用BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切，IgG Fc 片段用EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。

1.3 pcDNA3.1（+）/OX40Ig融合基因表達載體的構建 按耿潔等［5］pcDNA3.1（+）/IgG Fc 質(zhì)粒構建方法構建質(zhì)粒，取pcDNA3.1（+）/IgG Fc 與OX40 胞外區(qū)序列連接反應產(chǎn)物，應用熱休克法轉化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，堿裂解法小量提取質(zhì)粒。質(zhì)粒產(chǎn)物進行BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)約600 bp 的目的條帶，則初步鑒定為正確的重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1（+）/OX40Ig并測序鑒定。

1.4 大鼠ADSCs 分離培養(yǎng)及鑒定 1.2 中雄性Lewis 大鼠再取血后，無菌條件下取單側腹股溝脂肪組織，參照文獻［5］分離并提取ADSCs，應用流式細胞術及油紅O染色、茜素紅染色法對第3代ADSCs 表面標志物（CD90、CD105、CD73、CD34及CD45）及ADSCs誘導多向分化潛能進行鑒定。其中細胞表面標志物表達＞95%為陽性，＜1%為陰性；成脂細胞誘導觀察細胞質(zhì)內(nèi)球形脂滴情況，成骨細胞誘導觀察深染鈣結節(jié)形成情況。

1.5 ADSCs轉染和OX40Ig蛋白表達水平檢測 ADSCs消化成單細胞懸液，參照文獻［5］采用核轉染技術將pcDNA3.1（+）/OX40Ig質(zhì)粒轉染至ADSCs。重組質(zhì)粒轉染ADSCs 后72 h，Western blot法檢測ADSCs中OX40Ig表達，分離的蛋白電泳轉移到聚二氟乙烯膜上，BSA封閉液封閉后加重組Anti-OX40抗體4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000）室溫下和聚二氟乙烯膜孵育1 h，用增強化學發(fā)光反應顯色陽性條帶。

1.6 混合淋巴細胞反應 異氟醚吸入麻醉后，將4 只BN 大鼠和4 只Lewis 大鼠通過異氟醚吸入麻醉后取脾臟，通過尼龍濾網(wǎng)過濾法制備脾細胞懸液，再經(jīng)淋巴細胞分離液分離并經(jīng)尼龍毛柱法獲得淋巴細胞。取2×106/mL的BN大鼠淋巴細胞懸液并加入25 mg/L 絲裂霉素C，于37 ℃作用30 min，以1 500 r/min 離心 10 min，RPMI 1640 培養(yǎng)液洗滌后調(diào)整為 2×106/mL作為刺激細胞。將Lewis大鼠淋巴細胞1×105/孔（反應細胞）與刺激細胞2×105/孔混合接種于96孔培養(yǎng)板中。每孔加入絲裂霉素C 處理過的ADSCs、ADSCsOX40Ig（2×104/孔），實驗分為對照組（反應細胞+刺激細胞）、ADSCs 組（反應細胞+刺激細胞+ADSCs）及ADSCsOX40Ig組（反應細胞+刺激細胞+ADSCsOX40Ig）；每組設3個復孔，37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)4 d后采用MTT法測定淋巴細胞增殖的吸光度（A）值，并計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-A實驗組/A對照組）×100%。

1.7 逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測淋巴細胞內(nèi)IFN-γ、IL-10及轉化生長因子（TGF）-βmRNA 表達水平 收集混合淋巴細胞反應培養(yǎng)72 h 后的淋巴細胞，采用TRIzol 法提取總RNA，取總RNA 5 μg反轉錄為cDNA，產(chǎn)物體積20 μL。IFN-γ引物：上游 5′-AGGCCATCAGCAACAACATAAGTG-3′，下游5′-GACAGCTTTGTGCTGGATCTGTG-3′；IL-10引物：上游5′-AAGGCCATGAATGAGTTTGACAT-3′，下游 5′-CGGGTGGTTCAATTTTTCATTT-3′；TGF-β引物：上游 5′-CAAGGGCTACCATGCCAACT-3′，下游5′-CCGGGTTGTGTTGGTTGTAGA-3′；內(nèi)參基因β-actin引物：上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTCC-3′，下 游 5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。反應條件：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火和延伸 60 s，40 個循環(huán)。記錄Ct 值，以 2-ΔCt表示IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA的相對表達水平，其中ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，2 組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/OX40Ig，電泳結果顯示目的基因條帶對應1 000 bp；BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/OX40Ig，電泳結果顯示目的基因條帶對應570 bp，見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒的測序鑒定 重組質(zhì)粒測序鑒定與GenBank上公布的目標序列完全一致，無插入、缺失和移碼突變，表明質(zhì)粒構建正確，見圖2。

2.3 大鼠ADSCs 的體外培養(yǎng)和鑒定 ADSCs 傳代后細胞形態(tài)為長梭形并呈漩渦狀幾何倍數(shù)穩(wěn)定增長。ADSCs 表面分子 CD90、CD105 和 CD73 呈陽性表達，CD34、CD45呈陰性表達，見圖3。ADSCs在成脂及成骨細胞誘導液培育下分化為脂肪細胞和成骨細胞，見圖4。

2.4 OX40Ig 蛋白在ADSCs 細胞中的表達情況 重組質(zhì)粒轉染ADSCs細胞后，OX40Ig在ADSCs中呈高表達，見圖5。

2.5 ADSCsOX40Ig對異基因淋巴細胞增殖反應的影響 與ADSCs 組（46.7%±3.1%）比較，ADSCsOX40Ig組（60.5%±4.4%）異基因淋巴細胞增殖抑制率增強（n=4，t=5.085，P＜0.01）。

2.6 3 組IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA 表達水平比較 對照組、ADSCs 組及ADSCsOX40Ig組的IFN-γmRNA 相對表達水平依次降低，而IL-10、TGF-βmRNA相對表達水平依次升高（P＜0.01），見表1。

Fig.1 Validation of the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/OX40Ig圖1 pcDNA3.1（+）/OX40Ig質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig.2 DNA sequencing graph of pcDNA3.1(+)/OX40Ig圖2 pcDNA3.1（+）/OX40Ig重組質(zhì)?；驕y序圖

Fig.3 Phenotypic characterization of ADSCs圖3 ADSCs表型特征

Fig.4 ADSCs multilineage differentiation capacity(×200)圖4 ADSCs多向分化能力（×200）

Fig.5 Expression of OX40Ig detected by Western blot analysis圖5 Western blot檢測OX40Ig融合蛋白表達情況

Tab.1 Comparison of IFN-γ,IL-10 and TGF-β mRNA between the three groups表1 3組IFN-γ、IL-10、TGF-β mRNA表達水平比較（n=4，）

Tab.1 Comparison of IFN-γ,IL-10 and TGF-β mRNA between the three groups表1 3組IFN-γ、IL-10、TGF-β mRNA表達水平比較（n=4，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與ADSCs組比較，P＜0.05

組別對照組ADSCs組ADSCsOX40Ig組F IFN-γ 1.54±0.18 0.59±0.06a 0.26±0.05ab 127.923＊＊IL-10 0.20±0.01 0.55±0.04a 0.72±0.03ab 307.696＊＊TGF-β 0.17±0.02 0.34±0.03a 0.44±0.03ab 83.180＊＊

3 討論

3.1 共刺激分子-Ig 融合蛋白用于共刺激通路阻斷 研究顯示，激活T 細胞所必需的共刺激分子信號（第二信號）主要來自CD28、可誘導共刺激分子、OX40 等共刺激途徑［6］。OX40/OX40L 對維持效應 T細胞的活化、增殖及T 細胞免疫記憶等發(fā)揮重要生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，OX40基因敲除小鼠因喪失增殖分化能力，T細胞活化后會大量凋亡，而增強OX40基因表達可阻止T細胞無反應狀態(tài)并打破基因敲除小鼠已建立的外周免疫耐受［7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，OX40可作為預測急性排斥反應的一個分子標志物，是T 細胞介導免疫應答的關鍵共刺激分子［8-9］。共刺激分子與Ig融合蛋白通過重組工程技術可產(chǎn)生共刺激分子-Ig 融合蛋白，用于共刺激阻斷；與其他免疫抑制策略比較，共刺激分子-Ig融合蛋白可更好地誘導特異性免疫耐受并減少脫靶效應［10］。Kitchens等［11］研究顯示，Balatacept與人源化抗OX40L抗體組合給藥可顯著延長非靈長類動物移植腎存活時間。Chen 等［12］研究顯示，通過腺病毒介導OX40Ig基因表達來阻斷OX40-OX40L 信號通路，可抑制大鼠同種異體肝移植排斥反應，并通過降低IL-2表達而誘導免疫耐受。本實驗所構建的pcDNA3.1（+）/OX40Ig質(zhì)粒 DNA 序列測序鑒定結果表明，DNA 序列與目標序列完全匹配，無插入、缺失和移碼突變，表明成功構建了真核表達重組質(zhì)粒，因此通過OX40-OX40L阻斷誘導免疫耐受有望成為一種有前景的治療策略。

3.2 ADSCs 應用 根據(jù)全球最大的臨床試驗登記系統(tǒng)Clinical Trials 的數(shù)據(jù)，全球共有數(shù)千項間充質(zhì)干細胞（MSCs）治療相關的臨床研究登記注冊，主要研究MSCs治療某種特定疾病的安全性和有效性［13］。ADSCs 具有取材方便、易于標準化大規(guī)模生產(chǎn)以及可被基因修飾等特點。此外，ADSCs 具有比骨髓MSCs更強的免疫調(diào)節(jié)能力，是具有臨床應用前景的種子細胞［14-15］。Sánchez-Guijo 等［16］對 13 例重癥新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者在接受機械通氣的情況下給予ADSCs治療，結果表明，ADSCs可在重癥COVID-19 患者中安全使用，并且大多數(shù)受試者臨床癥狀得到改善。本研究結果顯示，ADSCs 表面標志物CD90、CD105和CD73呈陽性表達，而造血干細胞表面標志物CD34、白細胞共同抗原CD45 均呈陰性表達，同時ADSCs 具有誘導分化為脂肪細胞和成骨細胞能力，表明來自脂肪組織所分離培養(yǎng)擴增的細胞為MSCs。鑒于ADSCs 的這些獨特優(yōu)勢，ADSCs有望成為共刺激分子誘導特異性免疫耐受的理想的基因運載工具。

3.3OX40Ig基因修飾ADSCs 免疫耐受通常指當ADSCs 遷移到目標組織時，共刺激分子融合蛋白可以在局部持續(xù)釋放，同時發(fā)揮ADSCs免疫調(diào)節(jié)、損傷修復等多方面作用，兩者可協(xié)同誘導免疫耐受，且不存在常規(guī)免疫抑制劑帶來的不良反應。研究顯示，利用基因工程技術將共刺激分子融合蛋白基因轉染至ADSCs，可使ADSCs 在體內(nèi)持續(xù)分泌特定融合蛋白并延長融合蛋白在體內(nèi)的半衰期，發(fā)揮細胞治療與基因治療對誘導免疫耐受的協(xié)同作用［17］。目前，ADSCs可以較容易地用已知的病毒和非病毒載體進行轉導，并有效地過表達轉基因產(chǎn)物，這使得用基因工程技術開發(fā)以ADSCs為基礎表達所需治療因子的構想成為可能［18］。本研究使用核轉染方法將pcDNA3.1（+）/OX40Ig重 組 質(zhì) 粒 轉 染 ADSCs，Western blot結果顯示，ADSCs細胞中OX40Ig蛋白表達顯著升高，表明通過核轉染技術重組質(zhì)粒能夠成功介導融合蛋白在真核細胞中的表達，從而為進一步研究其對淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用打下基礎。

3.4 ADSCsOX40Ig對異基因淋巴細胞的免疫抑制作用 本研究結果顯示，與ADSCs 比較，ADSCsOX40Ig在體外可顯著增強異基因淋巴細胞增殖抑制率，表明ADSCsOX40Ig表達OX40Ig 并具有生物學功能，提示ADSCs可能通過與淋巴細胞直接接觸抑制了異基因淋巴細胞的增殖，進而發(fā)揮其免疫抑制作用，并通過OX40Ig阻斷T細胞之間的OX40/OX40L共刺激信號通路進一步增強了其對ADSCs 的免疫抑制作用，從而發(fā)揮兩者協(xié)同誘導異基因淋巴細胞的低反應性作用。相關研究顯示，應用MSCs 或阻斷OX40 共刺激通路均可通過影響Th 的極化來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［2，19］。IFN-γ、IL-10 以及 TGF-β 分別是 Th1、Th2及調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）表達和釋放的主要細胞因子［20］。本研究結果顯示，與ADSCs 比較，ADSCsOX40Ig能夠進一步下調(diào)淋巴細胞IFN-γmRNA 表達，同時上調(diào)IL-10和TGF-βmRNA 表達，提示上調(diào)的IL-10及TGF-β使混合淋巴細胞反應體系中的T淋巴細胞群由促炎性Th1 占主導向抗炎性Th2 和Treg 偏移，從而發(fā)揮負性免疫調(diào)節(jié)作用。因此，筆者認為，OX40Ig基因修飾的ADSCs 可同時發(fā)揮ADSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用和OX40Ig的共刺激阻斷作用，協(xié)同誘導免疫耐受，其可成為抑制異基因淋巴細胞活化及誘導其低反應性的有效策略，但ADSCsOX40Ig在體內(nèi)是否發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用仍有待深入研究。