陳悅悅 劉 勇 陳銀楠 李 巍▲

1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江蘇揚州 225009；2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，遼寧盤錦 124221

苯妥英是治療癲癇持續(xù)性發(fā)作的重要二線藥物[1-2]。其代謝清除主要由人肝微粒體細胞色素P450（cytochrome P450，CYPs）超家族的CYP2C9 和CYP2C19負責(zé)，其中CYP2C9 貢獻率達90%[3]。苯妥英治療窗窄，血藥濃度易受同服藥物影響[3]，尤其在惡性腫瘤合并癲癇的患者中，同服多種藥物存在基于對肝微粒體CYPs 抑制而導(dǎo)致苯妥英血藥濃度提高，進而引起不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險[4]。鴉膽子油軟膠囊和鴉膽子油乳注射液是已上市的應(yīng)用于腫瘤輔助治療的中成藥[5-6]，其抗腫瘤的主要活性成分是鴉膽子苦醇和鴉膽子素D[7-8]。此外，水飛薊是國內(nèi)外多種護肝保健品中的主要活性成分，也是用于治療抗腫瘤藥物導(dǎo)致肝損傷的重要藥物之一[9-10]。水飛薊賓A 和水飛薊賓B 是其發(fā)揮抗氧化、抗纖維化和肝臟保護等作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。鴉膽子和水飛薊制劑與苯妥英在癲癇合并腫瘤患者中均存在聯(lián)合使用的可能，但上述活性成分對人肝微粒體CYPs 催化苯妥英代謝的影響尚無相關(guān)報道。本研究使用人肝微粒體體外孵育體系，探討鴉膽子苦醇、鴉膽子素D、水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對CYPs 催化苯妥英代謝的抑制作用，并為以服用中藥為輔助藥物治療的臨床惡性腫瘤合并癲癇患者提供參考依據(jù)，以避免臨床中藥-西藥相互作用導(dǎo)致的不良反應(yīng)的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

QTRAP 6500+三重四級桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX 公司）：配有電噴霧離子化源（ESI）和Analyst 1.4.2 數(shù)據(jù)處理軟件；ExionLCTM 超高效液相色譜儀（美國AB SCIEX 公司）：配置四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱；VORTEX-2 渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司）；AUY120 電子天平（島津國際貿(mào)易有限公司）；SY-1220 恒溫水浴槽（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；ThermoStat C 恒溫孵育器（美國eppendorf 公司）。

人肝微粒體（批號：201801SUBK）購自上海瑞德肝臟疾病研究有限公司；氯化鎂（批號：20150202）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；苯妥英（批號：C1512060）、甲酸（批號：H2014333）購自阿拉丁公司；傘形酮（批號：BCCC1923）和5-（4 羥基苯基）-5-苯基乙內(nèi)酰脲（p-HPPH）（批號：0021309）購自美國Sigma公司；1-氨基苯并三唑（批號：41043）購自Medchem Express 公司；乙腈（批號：20230531）和甲醇（批號：20230331）購自德國Merck 公司；水飛薊賓A（批號：K1610034）、水飛薊賓B（批號：CFS201902）購自武漢中標(biāo)科技有限公司；鴉膽子苦醇（批號：P12J10F79833）、鴉膽子素D（批號：Y08M631）和還原型輔酶Ⅱ（NADPH，批號：B29N8T49218）購自上海源葉公司；純度均大于98%。其他的試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 水飛薊賓A、水飛薊賓B、鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 均用乙腈分別溶解稀釋成三種濃度梯度（1.000、5.000 和10.000 mmol/L）的工作液待用。另將水飛薊賓A 和水飛薊賓B 用乙腈分別配制成濃度梯度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 和8.000 mmol/L 的工作液。CYPs 廣泛抑制劑1-氨基苯并三唑（ABT）用乙腈稀釋成濃度為5.000 mmol/L 的儲備液備用。另使用乙腈配制4.000 mmol/L 的苯妥英工作液，20.000 mmol/L 傘形酮工作液。使用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCL，100.000 mmol/L，pH=7.4）配制50.000 mmol/L NADPH 工作液，上述溶液均保存于-20°C。蒸餾水配制500.000 mmol/L 的氯化鎂工作液，臨用臨配。

1.2.2 水飛薊賓A、水飛薊賓B、鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 對人肝微粒體CYPs 催化的苯妥英代謝的抑制作用 鴉膽子苦醇、鴉膽子素D、水飛薊賓A、水飛薊賓B 和空白對照（乙腈）中分別加入Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4，終濃度為100.000 mmol/L）、人肝微粒體（終濃度為0.100 mg/ml）、苯妥英（終濃度為20.000 μmol/L）和氯化鎂（終濃度為5.000 mmol/L），37℃預(yù)孵育3 min后，加入NADPH（終濃度為1.000 mmol/L）起始反應(yīng)，繼續(xù)孵育40 min 后通過加入200.000 μl 含內(nèi)標(biāo)（0.200 μmol/L 的傘形酮）的乙腈終止反應(yīng)。陽性對照（廣泛CYPs 抑制劑：50.000 μmol/L 的ABT）與微粒體反應(yīng)體系（與上述終濃度相同的Tris-HCl 緩沖液、人肝微粒體、氯化鎂和NADPH）預(yù)孵育30 min，然后加入苯妥英，孵育40 min 后加入200 μl 含內(nèi)標(biāo)的乙腈終止反應(yīng)。

1.2.3 水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對人肝微粒體CYPs催化的苯妥英代謝抑制的半抑制濃度 （50% inhibiting concentration，IC50） 計算方法 向反應(yīng)體系（100.000 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl 緩沖液，含苯妥英20.000 μmol/L、氯化鎂5.000 mmol/L、人肝微粒體0.100 mg/ml）中分別加入水飛薊賓A 或水飛薊賓B（0.000、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 和80.000 μmol/L），預(yù)孵育3 min 后起始反應(yīng)（NADPH 1.000 mmol/L），繼續(xù)孵育40 min 后加入200 μl 含內(nèi)標(biāo)（0.200 μmol/L 的傘形酮）的乙腈終止反應(yīng)。計算相對于0.000 μmol/L 組的剩余活性百分比。使用Graph-Pad Prism 8.0.1 進行非線性回歸，計算水飛薊賓A 或水飛薊賓B 對人肝微粒體CYPs 催化的苯妥英代謝抑制的IC50。

1.2.4 色譜條件 使用高效液相色譜和質(zhì)譜儀測定苯妥英的代謝產(chǎn)物，采用ACQUITY UPLC?C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱分離反應(yīng)混合物，柱溫35℃；采用流動相A（含0.1%甲酸的水）和流動相B（含0.1%甲酸的乙腈）進行線性梯度洗脫。洗脫條件：0～1.5 min，10%流動相B；1.5～3.5 min，70%流動相B；3.5～4.5 min，10%流動相B；流速：0.3 ml/min；進樣量：2 μl。

1.2.5 質(zhì)譜條件 采用電噴霧ESI 離子源，正離子模式掃描，噴霧電壓為5500 V，碰撞氣為Medium，離子源霧化器為20 psi，加熱輔助器為20 psi，氣簾氣為35 psi，離子傳輸毛細管溫度為450℃。采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple-reaction monitoring，MRM）定量p-HPPH 和內(nèi)標(biāo)。用于定量的離子及碰撞能量見表1。

表1 苯妥英代謝產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測條件

1.3 觀察指標(biāo)

測定苯妥英的代謝產(chǎn)物p-HPPH 與內(nèi)標(biāo)峰面積，將兩者比值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算苯妥英代謝的反應(yīng)速率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 8.0.1 處理，實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。使用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

選取濃度范圍為0.005～2.500 μmol/L 的p-HPPH標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，苯妥英代謝產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程Y=22.012X+0.205（r2=0.9994）。

2.2 水飛薊和鴉膽子主要活性成分苯妥英代謝產(chǎn)物p-HPPH 的抑制作用

鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 在10.000、50.000 和100.000 μmol/L 濃度下的反應(yīng)速率與0.000 μmol/L比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1A、B）。水飛薊賓A 在10.000、50.000 和100.000 μmol/L 濃度下苯妥英代謝產(chǎn)物p-HPPH 的生成速率分別為4.360、0.450和0.100 pM/（min·mg）pro，低于0.000 μmol/L時的14.060 pM/（min·mg）pro，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。水飛薊賓B 在10.000、50.000 和100.000 μmol/L濃度下p-HPPH 的生成速率分別為5.940、0.002 和～0.000 pM/（min·mg）pro，低于0.000 μmol/L 時的12.500 pM/（min·mg）pro，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1C、D）。

圖1 鴉膽子苦醇、鴉膽子素D、水飛薊賓A 和水飛薊賓B 分別在不同濃度時對苯妥英代謝產(chǎn)物p-HPPH 生成速率的影響

2.3 水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對p-HPPH 生成抑制的IC50

為進一步獲得水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對人肝微粒體CYPs 催化苯妥英生成p-HPPH 抑制的IC50，分別計算上述兩化合物濃度為1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 和80.000 μmol/L 時對苯妥英代謝產(chǎn)物p-HPPH 生成的抑制率。非線性回歸獲得水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對p-HPPH 生成抑制IC50分別為7.670 μmol/L 和15.490 μmol/L。

3 討論

苯妥英是臨床最常用的抗癲癇藥物之一，主要由CYP2C9 代謝。由于其治療窗窄，且藥代動力學(xué)曲線呈非線性，因此苯妥英血藥濃度的微弱變化均可顯著影響其療效和毒副作用[12]。臨床中很多癲癇患者在服用苯妥英治療的同時也服用了中藥作為輔助治療，因此增加了藥物相互作用的風(fēng)險[13-14]。因而在體外研究苯妥英與中藥的具體活性成分的相互作用具有重要的臨床意義。本研究探討鴉膽子苦醇和鴉膽子素D對苯妥英代謝的影響，結(jié)果顯示鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 對苯妥英代謝無明顯抑制作用，提示上述化合物與苯妥英共服時可能不會發(fā)生基于CYPs 抑制而導(dǎo)致的苯妥英藥代動力學(xué)性質(zhì)的改變。目前尚未有研究報道鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 在體內(nèi)主要由何種酶代謝，由此結(jié)果可推測催化苯妥英代謝的CYP2C9和CYP2C19 可能在代謝鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 中發(fā)揮的作用較小。

水飛薊活性成分制劑在國內(nèi)常作為保肝處方藥使用。此外，國內(nèi)外也將其作為保健品食用，人們通常認為其安全無副作用，因而忽視藥物相互作用造成的影響。目前已有研究和病例報道證實水飛薊可以抑制CYP2C9 底物甲苯磺丁脲和華法林的代謝[15-17]，但水飛薊與苯妥英的相互作用并不清楚。本研究探討水飛薊的主要成分水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對苯妥英代謝的影響，證實水飛薊賓A 和水飛薊賓B 可抑制人肝微粒體CYPs 催化的苯妥英代謝。中藥對CYP2C9酶的抑制程度可大致分為強抑制（IC50＜10 μmol/L）、中等抑制（10 μmol/L＜IC50＜50 μmol/L）、弱抑制（IC50＞50 μmol/L）[17]。本研究結(jié)果顯示，水飛薊賓A 是p-HPPH生成的強抑制劑（IC50=7.670 μmol/L），水飛薊賓B 為中等強度抑制劑（IC50=15.490 μmol/L）。與以往水飛薊賓B 對CYP2C9 底物華法林代謝的抑制作用強于水飛薊賓A 的結(jié)果相反[18]。相關(guān)機制仍有待進一步研究。

健康志愿者在服用120 mg 水飛薊制品后，體內(nèi)水飛薊賓濃度最大可達12.5 μmol/L[19]。因此可推測水飛薊賓A 和水飛薊賓B 在體內(nèi)極有可能抑制苯妥英的代謝而引起臨床不良反應(yīng)的發(fā)生。但中藥由于其復(fù)雜性，吸收進入體內(nèi)的量并不清楚，因此體內(nèi)和體外的差異性問題仍值得關(guān)注。水飛薊賓A 和水飛薊賓B抑制苯妥英的代謝也仍需進一步的臨床研究證實其相關(guān)性。CYP2C9 和CYP2C19 均具有高度多態(tài)性，也是影響苯妥英代謝的主要原因之一[20]。目前已證實攜帶一個或兩個有缺陷的CYP2C9 等位基因的個體在使用常規(guī)劑量苯妥英治療時更易發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)和嚴(yán)重的皮膚不良反應(yīng)[21]。本研究僅以人肝微粒體探究了水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對苯妥英代謝的影響，水飛薊賓A 和水飛薊賓B 在CYP2C9 的突變體體系中對苯妥英的影響值得進一步深究。

綜上所述，水飛薊賓A 和水飛薊賓B 與苯妥英共服時可能通過抑制CYPs 增加體內(nèi)苯妥英血藥濃度，進而引發(fā)臨床不良反應(yīng)的風(fēng)險，對于預(yù)測中藥-西藥相互作用，為指導(dǎo)臨床中藥-西藥合理聯(lián)用在治療腫瘤合并癲癇的患者中具有重要意義。