孫艷蕓，朱普生，刁 明，崔金霞，徐 巍，劉慧英

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】設(shè)施栽培復(fù)種指數(shù)、施肥量和集約化程度相對過高，設(shè)施內(nèi)土壤出現(xiàn)次生鹽漬化、養(yǎng)分失衡、土壤酸化等問題，其中鹽脅迫是設(shè)施作物遭受的主要逆境之一且對作物的正常生長發(fā)育及產(chǎn)量的限制最為顯著[1]。NaCl脅迫下植物無法保持正常的營養(yǎng)平衡和滲透調(diào)節(jié)，使得植物細胞內(nèi)葉綠體和線粒體電子傳遞過程中泄漏的電子數(shù)增加[2]，造成活性氧(ROS)大量積累及膜系統(tǒng)氧化損傷；引發(fā)光抑制及光合電子傳遞系統(tǒng)失活[3]；植物體內(nèi)的激素平衡遭到破壞以及積累的生物量減少[4]；誘使蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生變性，從而導(dǎo)致細胞死亡[5]。緩解NaCl脅迫對設(shè)施作物生長發(fā)育和產(chǎn)量造成的不良影響，研究設(shè)施作物的鹽適應(yīng)性作用機理，對提高設(shè)施作物的抗鹽性有重要意義。【前人研究進展】一氧化氮(NO)作為一種重要的信號分子存在于各個生物體內(nèi)，在植物生長發(fā)育的過程中，以及參與鹽、干旱和病原菌侵染等逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中有著重要作用[6-12]。有試驗證實，外源NO參與了植物應(yīng)答鹽脅迫的反應(yīng)[2]。外源NO可緩解小麥葉片的氧化損傷[13]、提高黃瓜幼苗的抗氧化能力[14]、減輕NaCl脅迫對番茄幼苗的傷害[15]等，增強植物的適應(yīng)能力。NaCl脅迫下NO通過3種途徑以緩解NaCl脅迫對植物的傷害：(1)降低植物細胞對Na+的吸收及增加K+的含量；(2)提高脯氨酸(Pro)的含量；(3)提高各種抗氧化酶的活性[16]。此外研究還發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)巰基亞硝基化，即NO與蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基(-SH)生成巰亞硝基(-SNO)，使蛋白構(gòu)象和活性發(fā)生改變的一種參與氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)機制，成為NO發(fā)揮其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的一種新的重要途徑[17]。而NO與谷胱甘肽(GSH)形成的S-亞硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione，GSNO)是當前主要亞硝基供體[18]。GSNO是一種-亞硝基硫醇類化合物。其廣泛存在于各種生物體中，是生物體天然存在的一氧化氮供體(儲存體)，可以在體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生，也可運輸，并在合適位置釋放出一氧化氮，因此，也是重要的一氧化氮緩沖和儲存體系[19]。內(nèi)源GSNO對于生物體多種信號傳導(dǎo)和生物體防御應(yīng)答是通過參與GSH、NO、蛋白質(zhì)類亞硝基硫醇(SNOs)水平的調(diào)節(jié)、介導(dǎo)翻譯后蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基的巰基亞硝基化和巰基谷胱甘肽化修飾來發(fā)揮作用的[20]。目前GSNO作為一種在有機體內(nèi)運輸和儲存NO的工具，已經(jīng)用于臨床防止驚厥以及阻止血小板凝集。也可以作為醫(yī)用NO制作原料?！颈狙芯壳腥朦c】而GSNO在植物上的應(yīng)用研究還比較少，尤其是參與植物抗逆調(diào)控(包括鹽適應(yīng)性)的相關(guān)研究較少，且大多研究是以硝普鈉(SNP)作為NO供體。番茄(LycopersiconesculentumMill)是目前我國設(shè)施生產(chǎn)的主要栽培的作物品種之一，屬于中度耐鹽性作物，是研究作物耐鹽性常用的模式植物?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以番茄為試材，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)的方法，以GSNO作為外源NO供體研究其不同濃度水平對鹽脅迫下番茄幼苗生長的影響，篩選出用于提高番茄耐鹽性的適宜施用濃度，為GSNO在提高植物鹽適應(yīng)性的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 番茄品種

試驗在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗站進行。試驗材料選用番茄品種中蔬4號。番茄種子經(jīng)浸種催芽后播種于基質(zhì)(草炭∶蛭石=2∶1(V/V))中。待番茄幼苗長至2葉1心，將精心選出的長勢整齊一致的番茄幼苗移栽到帶泡沫蓋板的容量為12 L的水桶中，裝入pH值為6.2的Hoagland營養(yǎng)液10 L。待番茄幼苗長至4葉1心時進行不同處理，其中氯化鈉(NaCl，100 mmol/L)于處理時直接加入營養(yǎng)液中，GSNO(外源NO供體)于每日09:00噴施于番茄幼苗的各個葉片上。在試驗進行期間，每間隔3 d對營養(yǎng)液的pH值進行1次調(diào)整并更換1次營養(yǎng)液。試驗期間保證溫室內(nèi)全天通氣。

1.1.2 GSNO制備

將等體積的200 mmol/L NaNO2(在0.5 mol/L HCl中)與等體積200 mmol/L GSH(在0.5 mol/L HCl中)混合，室溫避光反應(yīng)5 min，得到紅色產(chǎn)物。加入1 mol/L NaOH調(diào)整pH=7.0左右。以PBS為陰性對照分光光度儀測定334 nm處吸光度，所得吸光度值與GSNO摩爾吸光系數(shù)0.767相比得到GSNO母液的濃度。將GSNO母液分別稀釋為所需處理濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L)[22-23]。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置8個處理。

(1)CK:不噴GSNO不加NaCl和葉片噴施蒸餾水；

(2)NaCl:營養(yǎng)液添加0.1 mmol/L NaCl和葉面噴施雙蒸水；

(3)NaCl+GSNO0.1，營養(yǎng)液添加0.1 mol/L NaCl和葉面噴施0.1 mmol/L GSNO；

(4)NaCl+GSNO0.2，營養(yǎng)液添加0.1 mol/L NaCl和葉面噴施0.2 mmol/L GSNO;

(5)NaCl+GSNO0.3，營養(yǎng)液添加0.1 mol/L NaCl和葉片噴施0.3 mmol/L GSNO;

(6)NaCl+GSNO0.4，營養(yǎng)液添加0.1 mol/L NaCl和葉片噴施0.4 mmol/L GSNO；

(7)NaCl+GSNO0.5，營養(yǎng)液添加0.1 mol/L NaCl和葉片噴施0.5 mmol/L GSNO；

(8)NaCl+GSNO0.6，營養(yǎng)液添加0.1 mol/L NaCl和葉片噴施0.6 mmol/L GSNO。

試驗為隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)5株。在不同處理后第3 d取樣及測定。

1.2.2 測定指標

1.2.2.1 形態(tài)指標

株高：用軟尺測定莖基部到生長點的距離(cm)。

莖粗：用游標卡尺測定莖基部的粗度(cm)。

干重(DW)、鮮重(FW)測定：參照李合生[23]測定。

1.2.2.2 生理指標

丙二醛(MDA)含量：采用硫代巴比妥酸法[24]測定；

電解質(zhì)滲透率：采用PD-501便攜式多功能測量儀測定；

根系活力：采用 TTC 法[25]測定；

葉綠素含量：參照Arnon[26]測定；

脯氨酸(Pro)含量：采用酸性茚三酮顯色法[27]測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Microsoft Excel對試驗數(shù)據(jù)進行處理；使用SPSS19.0對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗(Duncan’s 法)，顯著性水平設(shè)定為 α=0.05；使用Origin2019b對試驗數(shù)據(jù)進行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度GSNO對鹽脅迫下番茄幼苗生長指標的影響

研究表明，與對照處理(CK)相比，NaCl脅迫處理后，番茄幼苗的各項生長指標(株高、莖粗、地上部和地下部的鮮重和干重)均顯著下降，其中株高下降了27.5%、莖粗下降了20.43%、地上部干、鮮重分別下降了37.67%和33.57%、地下部干、鮮重分別下降了37.50%和63.63%；與NaCl處理相比，鹽脅迫下施加0.1 mM GSNO(NaCl+GSNO0.1處理)顯著提高了番茄幼苗的莖粗、地上部和地下部干重，對株高、地上部和地下部鮮重?zé)o顯著影響；鹽脅迫下施加0.2 mM和0.3 mM GSNO(NaCl+GSNO0.2和NaCl+GSNO0.3處理)與NaCl脅迫處理相比僅顯著提高了番茄幼苗的地下部鮮重，對其它各項生長指標均無顯著影響；鹽脅迫下施加0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM GSNO(NaCl+GSNO0.4、NaCl+GSNO0.5和NaCl+GSNO0.6處理)較NaCl脅迫處理對番茄幼苗的生長指標無顯著差異。表1

表1 不同濃度GSNO對鹽脅迫下番茄幼苗生長指標變化Table 1 Effects of different concentrations of GSNO on growth indexes of tomato seedlings under salt stress

2.2 不同濃度GSNO對NaCl脅迫下番茄幼苗根系活力的影響

研究表明，與CK處理相比，NaCl脅迫下番茄幼苗的根系活力顯著下降了36.25%；與NaCl脅迫處理相比，NaCl+GSNO0.1和NaCl+GSNO0.22個處理下番茄幼苗的根系活力分別顯著提高了32.59%、25.96%，其中NaCl+GSNO0.1處理的根系活力顯著高于NaCl+GSNO0.2處理的。NaCl+GSNO0.3、NaCl+GSNO0.4和NaCl+GSNO0.53個處理下番茄幼苗的根系活力與NaCl脅迫處理相比無顯著差異，且3個濃度處理間的根系活力也無顯著差異。而NaCl+GSNO0.6處理下的番茄幼苗根系活力與NaCl脅迫處理相比顯著降低了18.48%。施用0.1 mmol/L的GSNO對NaCl脅迫下番茄幼苗根系活力的促進作用最好，其次為0.2 mmol/L的GSNO，而施用高濃度的GSNO(0.6 mmol/L)對NaCl脅迫下的番茄幼苗的根系活力具有抑制作用。表2

2.3 不同濃度GSNO對NaCl脅迫下番茄幼苗鹽脅迫下葉綠素含量的影響

研究表明，與CK處理相比，NaCl脅迫下番茄幼苗葉片的葉綠素a(Chla)含量顯著下降了26.20%，葉綠素b(Chlb)含量顯著下降了22.34%，葉綠素總量顯著下降了25.59%；與NaCl脅迫處理相比，NaCl+GSNO0.1、NaCl+GSNO0.2和NaCl+GSNO0.33個處理均顯著提高了Chla含量和葉綠素總量，對Chlb含量無顯著影響。3個處理中，NaCl+GSNO0.1處理的葉綠素總量顯著高于NaCl+GSNO0.2和NaCl+GSNO0.32個處理的Chlb含量顯著高于NaCl+GSNO0.3處理的Chla含量3個濃度處理間無顯著性差異。NaCl+GSNO0.2和NaCl+GSNO0.32個處理的Chla、Chlb和葉綠素總量均無顯著性差異；NaCl+GSNO0.4處理較NaCl脅迫處理顯著提高了Chla含量，對Chlb和總?cè)~綠素含量無顯著影響；與NaCl脅迫處理相比，NaCl+GSNO0.5和NaCl+GSNO0.62個處理均顯著降低了Chlb含量，但對Chla和葉綠素總量無顯著影響，且2個處理間無顯著性差異。表3

表2 不同濃度GSNO對鹽脅迫下番茄幼苗根系活力變化Table 2 Effects of different concentrations of GSNO on root activity of tomato seedlings under salt stress

表3 不同濃度GSNO對番茄鹽脅迫下幼苗葉片葉綠素含量變化Table 3 Effects of different concentrations of GSNO on chlorophyll content of tomato seedlings under salt stress after

2.4 不同濃度GSNO對NaCl脅迫下番茄幼苗電解質(zhì)滲透導(dǎo)率(EL)和丙二醛(MDA)含量的影響

研究表明，與CK處理相比，鹽脅迫使得番茄幼苗葉片的丙二醛(MDA)含量顯著提高，與CK相比顯著提高了43.17%，但對番茄幼苗葉片的電解質(zhì)滲透率(EL)無顯著影響；與鹽處理下的番茄幼苗比較，NaCl+GSNO0.1和NaCl+GSNO0.22個處理下番茄幼苗葉片的丙二醛(MDA)含量均顯著降低，但EL仍無顯著變化。NaCl+GSNO0.3、NaCl+GSNO0.4、NaCl+GSNO0.5和NaCl+GSNO0.64個處理下番茄幼苗葉片的EL和MDA含量與NaCl處理相比均無顯著影響。6個不同濃度的GSNO處理中，除NaCl+GSNO0.1的EL顯著低于NaCl+GSNO0.4、NaCl+GSNO0.5和NaCl+GSNO0.63個處理外，其它處理間的EL和丙二醛(MDA)含量均無顯著性差異。表4

2.5 不同濃度GSNO對脅迫下番茄幼苗鹽脅迫下脯氨酸(Pro)含量的影響

研究表明，相較于CK處理，鹽脅迫顯著提高了番茄幼苗葉片的脯氨酸(Pro)含量，相較于與鹽脅迫處理，NaCl+GSNO0.1、NaCl+GSNO0.2、NaCl+GSNO0.3、NaCl+GSNO0.4、NaCl+GSNO0.5，5個處理下番茄幼苗葉片的脯氨酸含量均顯著增加，NaCl+GSNO0.6處理下的脯氨酸含量則沒有顯著性差異。6個不同濃度GSNO處理中，NaCl+GSNO0.1的脯氨酸含量顯著高于NaCl+GSNO0.3、NaCl+GSNO0.4、NaCl+GSNO0.5和NaCl+GSNO0.64個處理。圖1

表4 不同濃度GSNO對鹽脅迫下番茄幼苗電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量變化Table 4 Effect of of different concentrations of GSNO on electrical conductivity and MDA content of tomato seedlings under salt stress

圖1 不同濃度GSNO對脅迫下番茄幼苗鹽脅迫下脯氨酸含量變化Fig.1 Effect of different concentrations of GSNO on proline content of tomato seedlings under Salt Stress

3 討 論

植物生長發(fā)育對NaCl脅迫非常敏感，可以用生長形態(tài)學(xué)指標來評價植物的耐鹽能力和鹽脅迫程度[29-30]。NaCl脅迫影響植物的生長發(fā)育通過滲透脅迫，離子傷害等過程實現(xiàn)[30]。此外，根系是植物對鹽脅迫信號最敏感的部分，會導(dǎo)致植物根系受損，阻礙了芽的生長。研究結(jié)果亦表明，脅迫顯著抑制了番茄幼苗的生長和根系活力。研究表明，NO是一種對植物體具有雙重性作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[32]，一方面NO可以通過改變細胞氧化還原狀態(tài)而參與植物的生長發(fā)育和對環(huán)境適應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，另一方面高濃度NO作為活性氮具有強硝化脅迫作用從而抑制植物生長。NO的雙重性作用主要根據(jù)具體濃度、施用部位及細胞的生理條件不同而展現(xiàn)出不同的作用[38-39]。內(nèi)源GSNO作為動物細胞內(nèi)一種運輸和儲存NO的工具，在生物體多種信號傳導(dǎo)和防御應(yīng)答上發(fā)揮重要作用。試驗結(jié)果表明，與NaCl脅迫相比較，NaCl+GSNO0.1、NaCl+GSNO0.2和NaCl+GSNO0.33個處理均在不同程度上顯著促進了番茄幼苗的生長，但其它3個較高濃度的GSNO處理下的番茄幼苗較NaCl脅迫的沒有顯著差異。外源施用適宜濃度的GSNO(0.1、0.2和0.3 mmol/L)能夠有效促進NaCl脅迫下番茄幼苗生長發(fā)育，提高番茄幼苗的耐鹽性。其中尤以施用0.1 mmol/L的GSNO對NaCl脅迫下番茄幼苗生長和根系活力的促進作用最好。但高濃度的GSNO(0.4、0.5和0.6 mmol/L)對NaCl脅迫下番茄幼苗生長沒有緩解作用，也沒有產(chǎn)生明顯的抑制作用。

葉綠素含量是反映植物光合作用強度的重要生理指標。當植物處于NaCl脅迫下時，葉綠素不能正常形成，導(dǎo)致其含量下降，無法維持正常合成與分解之間的平衡，導(dǎo)致光合作用強度減弱和葉片生長。植物被阻塞，使植物緩慢生長，減少葉片類型，并增加對植物的傷害[31]。試驗結(jié)果表明，NaCl脅迫下的番茄幼苗生長收到抑制的同時，伴隨著Chla、Chlb和葉綠素總量的顯著下降。而外源施用0.1、0.2和0.3 mmol/L GSNO均有效提高了NaCl脅迫下番茄幼苗葉片葉綠素總量及Chla，且以施用0.1 mmol/L GSNO的效果最好。但施用0.5和0.6 mmol/L GSNO的施用顯著降低了Chlb含量。較低濃度的GSNO可通過提高鹽脅迫下番茄幼苗的光合色素含量來促進番茄幼苗的光合作用和生長。而較高濃度GSNO(0.5和0.6 mmol/L)的施用通過降低捕光色素Chlb含量而影響番茄幼苗的光合作用和生長。

細胞膜對維持生物體細胞內(nèi)微環(huán)境和正常的代謝有著不可或缺的一部分[32]。在正常的生長環(huán)境下，植株內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除始終保持一種平衡，但逆境脅迫會打破這種平衡。逆境(包括鹽脅迫)會導(dǎo)致植物體內(nèi)的ROS過量產(chǎn)生和累積，這使得植物體內(nèi)細胞的膜脂過氧化程度提高和膜系統(tǒng)的完整性被破壞，影響植物正常的生長和發(fā)育。膜脂過氧化和膜透性增大的程度與植物抗逆性的強弱有關(guān)[33]，電解質(zhì)滲透率的和MDA含量已經(jīng)成為評價鑒定植物抗逆性強弱的有效指標。研究表明，NaCl脅迫處理導(dǎo)致膜脂過氧化程度提高和膜系統(tǒng)的完整性降低；而外源施用0.1和0.2 mmol/L GSNO 顯著降低了NaCl脅迫下番茄幼苗葉片的MDA含量，即顯著降低了膜脂過氧化程度。但0.3～0.6 mmol/L GSNO 的施用對NaCl脅迫下番茄幼苗葉片的電解質(zhì)滲透率和MDA無顯著影響，0.3～0.6 mmol/L GSNO對鹽脅迫下番茄幼苗葉片細胞的完整性和膜脂過氧化程度無影響。外源施用較低濃度(0.1和0.2 mmol/L)的GSNO能夠通過降低鹽脅迫下番茄幼苗體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和積累，保護細胞膜免于氧化脅迫，從而提高番茄幼苗的抗鹽性。

脯氨酸(pro)作為植物蛋白質(zhì)的重要組成部分之一，通常以游離狀態(tài)廣泛分布于植物體內(nèi)。在逆境環(huán)境下，許多植物體內(nèi)脯氨酸(Pro)含量大幅增加。積累的Pro不但可以作為植物細胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還可以穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)，降低細胞酸性，解除氨毒并且作為能量庫調(diào)節(jié)細胞氧化還原等[34]。植物體內(nèi)的Pro含量在一定程度上反映了植物的抗逆性[35]，往往抗鹽性越強植物體內(nèi)會積累更多的脯氨酸(Pro)。研究表明，在鹽脅迫下外源施用0.1～0.5 mmol/L GSNO均顯著增加番茄幼苗體內(nèi)的Pro含量，但0.6 mmol/L GSNO對鹽脅迫下番茄幼苗體內(nèi)的Pro含量無顯著影響。其中鹽脅迫下施用0.1 mmol/L GSNO番茄幼苗體內(nèi)Pro的含量顯著高于施用0.3～0.6 mmol/L GSNO的處理。外源施用較低濃度的GSNO能夠更好的提高番茄幼苗體內(nèi)Pro的累積，提高番茄幼苗的抗鹽性。

4 結(jié) 論

作為NO的供體的GSNO在低濃度(0.1～0.3 mmol/L)的施用可不同程度促進鹽脅迫下番茄幼苗生長和提高番茄幼苗的鹽適應(yīng)性。高濃度(0.4～0.6 mmol/L)GSNO的施用對鹽脅迫下番茄幼苗的生長和膜脂過氧化程度及膜的完整性無影響。但0.5和0.6 mmol/L GSNO的施用顯著降低鹽脅迫下番茄幼苗葉片的Chlb含量，0.6 mmol/L GSNO還顯著降低了鹽脅迫下番茄幼苗的根系活力。GSNO對鹽脅迫下番茄幼苗的生長亦具有濃度效應(yīng)，低濃度(0.1～0.3 mmol/L)GSNO可緩解鹽脅迫對番茄幼苗生長的抑制作用，高濃度(0.5～0.6 mmol/L)的GSNO已造成對植物的傷害，施用的高濃度尚未達到抑制鹽脅迫下番茄幼苗生長的濃度。NaCl脅迫顯著降低了番茄幼苗的根系活力和光合色素含量、加劇了膜脂過氧化和膜完整性的破壞程度，抑制了番茄幼苗的生長。而外源施用0.1～0.3 mmol/L GSNO可通過不同程度的提高葉綠素含量、根系活力，降低膜脂過氧化和膜完整性的破壞程度，提高脯氨酸含量而有效緩解鹽脅迫對番茄幼苗生長的抑制作用，提高番茄幼苗的抗逆性。其中尤以0.1 mmol/L GSNO施用效果最佳。高濃度(0.5～0.6 mmol/L)GSNO的施用雖對鹽脅迫下番茄幼苗的已造成傷害，但尚未達到抑制鹽脅迫下番茄幼苗生長的作用。