王敏　吳莎　郭麗　王晶　李明聰　劉榮　劉攀婷　肖航　駱?biāo)荚?/p>

摘要 目的：建立芎附滴丸（XFDP）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并對其進(jìn)行抗偏頭痛的藥效學(xué)研究。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定XFDP中8種主要成分的含量。評價XFDP對偏頭痛大鼠5-羥色胺（5-HT）、β-內(nèi)啡肽（β-EP）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、核因子κB（NF-κB）、一氧化氮合酶（NOS）含量，及Calca、c-fos mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：建立的HPLC法線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，各成分的平均加樣回收率和相應(yīng)的RSD分別為阿魏酸100.68（2.76%）、洋川芎內(nèi)酯I 98.71（2.88%）、洋川芎內(nèi)酯A 101.66（2.17%）、丁基苯酞100.15（2.60%）、Z-藁本內(nèi)酯99.50（2.88%）、Z-丁烯基苯酞102.47（2.22%）、香附烯酮100.11（2.91%）、α-香附酮100.66（3.03%）。偏頭痛造模后大鼠5-HT、β-EP含量顯著降低（P<0.01，P<0.01），CGRP、ET-1、MMP-9、核因子κB、NOS含量顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01），Calca、c-fos mRNA的表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）。XFDP可升高模型大鼠5-HT、β-EP含量，降低CGRP、ET-1、MMP-9、核因子κB、NOS含量，降低Calca、c-fos mRNA的表達(dá)，而發(fā)揮治療偏頭痛的作用。結(jié)論：本方法簡單、快速、準(zhǔn)確，可用于XFDP的質(zhì)量控制;XFDP通過調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)的表達(dá)發(fā)揮治療偏頭痛的作用。

關(guān)鍵詞 芎附滴丸;偏頭痛;藥效學(xué);高效液相色譜法

Abstract Objective：To establish quality standards and evaluate the anti-migraine effect of Xiongfu dripping pills.Methods：A HPLC method was used for simultaneous determination of 8 main components in Xiongfu dripping pills.The effects of Xiongfu dripping pills on the contents of 5-HT，β-EP，CGRP，ET-1，MMP-9，NF-κB，NOS and the mRNA expression of Calca and c-fos in migraine rats were evaluated.Results：The HPLC-DAD method determined the content of ferulic acid，senkyunolide I，senkyunolide A，3-butylphthalide，Z-ligustilide，Z-butylidenephthalide，cyperotundone and α-cyperone.The precision，repeatability and stability were favorable.The average recoveries and corresponding RSD values were 100.68（2.76%）、98.71（2.88%）、101.66（2.17%）、100.15（2.60%）、99.50（2.88%）、102.47（2.22%）、100.11（2.91%）、100.66（3.03%），respectively.Compared to normal rats，the levels of 5-HT and β-EP in migraine rats decreased significantly（P<0.01，P<0.01），CGRP，ET-1，MMP-9，NF-κB and NOS increased significantly（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01），and the mRNA expression of Calca and c-fos also increased significantly（P<0.05，P<0.01）.Xiongfu dripping pills significantly improved 5-HT and β-EP，reduced CGRP，ET-1，MMP-9，NF-κB，NOS and reduced the mRNA expression of Calca and c-fos to treat migraine.Conclusion：The HPLC method is simple，fast，accurate，and it can be used for the quality control of Xiongfu dripping pills.Xiongfu dripping pills treat migraine by regulating various neurotransmitters and vasoactive substances.

Keywords Xiongfu dripping pills; Migraine; Pharmacodynamics; HPLC

中圖分類號：R289.5;R541文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.004

偏頭痛是一種高發(fā)病率、反復(fù)發(fā)作的慢性功能障礙性疾病，全球偏頭痛發(fā)病率約11%[1]。近年來偏頭痛呈現(xiàn)日益上升的趨勢，嚴(yán)重影響著人們的身體健康與生命質(zhì)量。芎附方出自《丹溪心法》，由川芎、香附兩味中藥配伍組成，治氣厥頭痛、偏正頭痛。方中川芎上行頭目，下行血海，為血中之氣藥，善活血行氣，祛風(fēng)止痛。香附為氣病之總司，女科之主帥，善行氣化瘀、調(diào)經(jīng)止痛。臨床實(shí)踐證明川芎-香附配伍可治療偏頭痛[2-3]，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)亦證明芎附方可通過調(diào)節(jié)5-羥色胺、5-羥吲哚乙酸、多巴胺、一氧化氮合酶、降鈣素基因相關(guān)肽等而發(fā)揮治療偏頭痛的作用[4-6]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)將芎附方開發(fā)為芎附滴丸（XFDP）用于芎附方的臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）同時檢測XFDP中8種有效成分的含量，并進(jìn)行XFDP抗偏頭痛的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，以期為XFDP的質(zhì)量控制和藥效學(xué)評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取SPF級SD雄性大鼠36只，體質(zhì)量（200±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號SCXK（京）2016-0011。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于溫度25 ℃、濕度50%的屏障環(huán)境中。

1.1.2 藥物 川芎飲片（北京鶴延齡藥業(yè)發(fā)展有限公司，批號：170604）。

1.1.2 儀器與試劑 臺式多功能實(shí)驗(yàn)滴丸機(jī)（北京正大綠洲制藥有限公司，型號：TDSJ-A）;高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent公司，美國，型號：Agilent 1100）;全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號：Multiskan Go）;自動洗板機(jī)（Bio-rad公司，美國，型號：Bio-Plex Pro Ⅱ）;超微量紫外分光光度計(jì)（JENWAY公司，英國，型號：Genova Nano）;凝膠成像儀（GE公司，美國，型號：Image Quant 3500）;實(shí)時熒光定量PCR儀（Bio-rad公司，美國，型號：CFX connect）。醋香附飲片（北京人衛(wèi)中藥飲片廠，批號：17022102）;阿魏酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614）;洋川芎內(nèi)酯I（上海源葉生物科技有限公司，批號：B21463）;洋川芎內(nèi)酯A（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS170418-03）;丁基苯酞（上海源葉生物科技有限公司，批號：B21649）;Z-藁本內(nèi)酯（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS0322-0100）;Z-丁烯基苯酞（批號：B20300，上海源葉生物科技有限公司）;香附烯酮（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS010769）;α-香附酮（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS010758），上述對照品純度均在98%以上;琥珀酸舒馬普坦片（天津華津制藥有限公司，批號：7B6926T），硝酸甘油注射液（北京益民藥業(yè)有限公司，批號：20170808）;TRIZOL.試劑（Invitrogen公司，美國，貨號：15596026）;Fastking RT Kit（with.gDNase，貨號：KR116-02）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green，貨號：FP-205-02）均購于天根生化科技北京有限公司;5-羥色胺試劑盒（批號：20180531）、降鈣素基因相關(guān)肽試劑盒（批號：20180531）、β-內(nèi)啡肽試劑盒（批號：20180531）、內(nèi)皮素-1試劑盒（批號：20180531）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（批號：20180531）、核因子κB試劑盒（批號：20180531）、總一氧化氮合成酶NOS試劑盒（批號：20181009）均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 XFDP的制備 取川芎62.5 g用90%乙醇浸漬，醋香附125.0 g用85%乙醇浸漬，再分別用16倍量乙醇進(jìn)行滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，藥液濃縮至相對密度1.20～1.30（50 ℃）的稠膏。稠膏與基質(zhì)PEG 6000（1∶2）混合，加熱熔融后，倒入滴丸機(jī)儲藥罐中，滴入裝有二甲基硅油的滴筒罐中，冷卻固化成丸，吸干冷卻劑，即得XFDP。用同樣的方法制備空白滴丸。

2.2 XFDP中主要成分的含量測定

1.2.2 色譜條件 采用Kromasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，10%～30% A;10～25 min，30%～35%A;25～45 min，35%～55% A;45～48 min，55%～65% A;48～75 min，65%～75%A;75～90 min，75%～80% A;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫25 ℃;檢測波長為250 nm和286 nm。

1.2.3 混合對照品溶液的制備 將阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯、Z-丁烯基苯酞、香附烯酮和α-香附酮，分別精密稱取1.750 mg、1.405 mg、37.975 mg、2.503 mg、50.951 mg、1.925 mg、5.425 mg、1.475 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯、Z-丁烯基苯酞、香附烯酮和α-香附酮濃度分別為0.070 mg/mL、0.056 mg/mL、1.519 mg/mL、0.100 mg/mL、2.038 mg/mL、0.077 mg/mL、0.217 mg/mL和0.059 mg/mL的混合對照品儲備液。

1.2.4 供試品溶液的制備 取XFDP約0.5 g，研細(xì)后精密稱重，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇5 mL，稱重，超聲30 min至室溫，用甲醇補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

1.2.5 偏頭痛藥效學(xué)實(shí)驗(yàn) 雄性SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、陽性藥組[琥珀酸舒馬普坦5.83 mg/（kg·d）]、XFDP低劑量組[含滴丸1.0 g/（kg·d）]、XFDP中劑量組[含滴丸1.5 g/（kg·d）]、XFDP高劑量組[含滴丸3.0 g/（kg·d）]，每組動物6只。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠后，按10 mL/kg體質(zhì)量劑量連續(xù)灌胃給藥5 d，灌胃1次/d?？瞻讓φ战M和模型對照組灌胃生理鹽水，給藥組灌胃XFDP。第5天給藥后30 min，于大鼠額區(qū)皮下注射硝酸甘油注射劑10 mg/kg。造模后2 h，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉后，腹主動脈取血，分離血清。取血后脫頸椎處死，分離腦干，凍實(shí)。

1.2.6 5-羥色胺（5-HT）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、β-內(nèi)啡肽（β-EP）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、核因子κB（NF-κB）、一氧化氮合酶（NOS）含量測定 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）測定左側(cè)腦干5-HT、CGRP、β-EP、ET-1、MMP-9、NF-κB含量，測定血清中NOS活力。

1.2.7 Calca和c-fos mRNA進(jìn)行相對表達(dá)量分析Trizol法提取右側(cè)腦干中總RNA。取1 μg總RNA模板，按照快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配成20 μL反應(yīng)體系合成第一鏈cDNA，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)條件為42 ℃，15 min，95 ℃，3 min。取0.8 μL cDNA模板，上下游引物各0.6 μL，按照擴(kuò)增試劑盒說明書配成20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，PCR熱循環(huán)參數(shù)：1）預(yù)變性：1X，95 ℃，15 min;2）PCR：40X，95 ℃，10 s，52 ℃，20 s，72 ℃，30 s;3）熔解曲線分析：每個樣本平行設(shè)置3個復(fù)孔，對各樣本的Calca和c-fos mRNA進(jìn)行相對表達(dá)量分析，采用2-△△ct法分析結(jié)果。引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XFDP中主要成分的含量測定

2.1.1 線性關(guān)系考察 以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。見表2。

2.1.2 專屬性試驗(yàn) 混合對照品溶液、XFDP供試品溶液和空白滴丸基質(zhì)溶液的色譜圖見圖1。XFDP中共檢測了8種成分，空白滴丸基質(zhì)中沒有上述8種成分對應(yīng)的色譜峰，說明空白滴丸基質(zhì)對上述成分的測定無干擾。見圖1。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 8個成分含量的RSD值，依次為阿魏酸1.64%，洋川芎內(nèi)酯I 1.57%，洋川芎內(nèi)酯A 1.20%，丁基苯酞0.34%，Z-藁本內(nèi)酯1.24%，Z-丁烯基苯酞1.29%，香附烯酮1.31%，α-香附酮1.37%，說明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 8個成分含量的RSD值依次為阿魏酸2.90%，洋川芎內(nèi)酯I 1.43%，洋川芎內(nèi)酯A 2.96%，丁基苯酞0.53%，Z-藁本內(nèi)酯2.09%，Z-丁烯基苯酞2.10%，香附烯酮2.68%，α-香附酮2.92%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 8個成分含量的RSD值依次為阿魏酸2.90%，洋川芎內(nèi)酯I 2.06%，洋川芎內(nèi)酯A 2.25%，丁基苯酞0.39%，Z-藁本內(nèi)酯2.39%，Z-丁烯基苯酞2.07%，香附烯酮2.64%，α-香附酮2.04%，結(jié)果表明上述供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 各成分的平均加樣回收率和相應(yīng)的RSD分別為阿魏酸100.68（2.76%）、洋川芎內(nèi)酯I 98.71（2.88%）、洋川芎內(nèi)酯A 101.66（2.17%）、丁基苯酞100.15（2.60%）、Z-藁本內(nèi)酯99.50（2.88%）、Z-丁烯基苯酞102.47（2.22%）、香附烯酮100.11（2.91%）、α-香附酮100.66（3.03%）。見表3。

2.1.7 XFDP含量測定 6批XFDP中8種成分的平均含量分別為阿魏酸0.44 mg/g、洋川芎內(nèi)酯I 0.18 mg/g、洋川芎內(nèi)酯A 2.55 mg/g、丁基苯酞0.23 mg/g、Z-藁本內(nèi)酯21.00 mg/g、Z-丁烯基苯酞0.17 mg/g、香附烯酮1.05 mg/g、α-香附酮0.21 mg/g。見表4。

2.2 5-HT、β-EP、CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS測定結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組大鼠5-HT、β-EP含量均顯著降低（P<0.01，P<0.01），含量顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。與模型對照組比較，陽性藥組5-HT、β-EP含量均顯著升高（P<0.01，P<0.01），CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS含量顯著降低（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。與模型對照組比較，XFDP低劑量組可顯著升高5-HT、β-EP含量（P<0.01，P<0.01），顯著降低CGRP、MMP-9、NF-κB、NOS含量（P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01），雖可降低ET-1含量但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型對照組比較，XFDP高、中劑量組均可顯著升高5-HT、β-EP含量（P<0.01，P<0.01），顯著降低CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS含量（P<0.01，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。結(jié)果說明，XFDP可通過升高腦干中5-HT、β-EP含量，降低腦干中CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB含量，降低血清中NOS含量，而發(fā)揮抗偏頭痛作用。見表5。

2.3 Calca、c-fos mRNA測定結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組大鼠Calca、c-fos mRNA的表達(dá)均顯著升高（P<0.05，P<0.01）。與模型對照組比較，陽性藥組Calca、c-fos mRNA的表達(dá)均顯著降低（P<0.05，P<0.05）。與模型對照組比較，XFDP低、中、高劑量組可顯著降低Calca、c-fos mRNA的表達(dá)（P<0.05，P<0.05）。結(jié)果說明，XFDP可通過降低腦干中Calca、c-fos mRNA的表達(dá)而發(fā)揮抗偏頭痛作用。見表6。

3 討論

偏頭痛的發(fā)病機(jī)制主要有三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說、皮質(zhì)擴(kuò)布性抑制學(xué)說和血管源學(xué)說[7]。基于這3種學(xué)說，本實(shí)驗(yàn)采用了硝酸甘油致偏頭痛大鼠模型，選取了5-HT、CGRP、β-EP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS等觀察指標(biāo)，研究XFDP抗偏頭痛的效果。

5-HT是中樞內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的重要神經(jīng)活性物質(zhì)之一。偏頭痛發(fā)作前期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT釋放增加，導(dǎo)致血管擴(kuò)張和硬腦膜蛋白外滲[8-9]。CGRP是廣泛存在于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)肽，由Calca基因編碼，具有很強(qiáng)的擴(kuò)血管作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)CSD模型大鼠血漿CGRP明顯增加[11]。頭痛發(fā)作時，偏頭痛患者血漿CGRP水平升高，且CGRP水平與頭痛強(qiáng)度、持續(xù)時間正比[12]。β-EP是主要的鎮(zhèn)痛遞質(zhì)，β-EP釋放減少將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)對外界刺激敏感度增強(qiáng)，從而引發(fā)偏頭痛[13]。ET是由21個氨基酸組成的血管收縮肽，在正常生理情況下，ET和CGRP處于動態(tài)平衡狀態(tài)，偏頭痛發(fā)作期患者血漿中血管活性物質(zhì)CGRP、ET含量異常，顱內(nèi)血管舒縮功能失衡[14]。偏頭痛發(fā)作會觸發(fā)三叉神經(jīng)感覺纖維釋放神經(jīng)肽，引起神經(jīng)源性炎癥，使MMP-9上升[15]。偏頭痛患者血漿中MMP-9含量遠(yuǎn)高于正常對照組[16]。NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的基因多向性轉(zhuǎn)錄因子，電刺激大鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜，可激活中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)核因子κB細(xì)胞[17]。NO是偏頭痛發(fā)病機(jī)制中的一個關(guān)鍵分子，NO可通過谷氨酸通路及降鈣素基因相關(guān)肽引起血管擴(kuò)張和神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生血管擴(kuò)張性頭痛[18]。NO由NOS產(chǎn)生，因此實(shí)驗(yàn)中選擇檢測血清中NOS的活性。研究證實(shí)c-fos基因異常表達(dá)與偏頭痛存在密切關(guān)系，偏頭痛發(fā)作期時增強(qiáng)三叉神經(jīng)核尾部內(nèi)的c-fos基因表達(dá)，用舒馬曲坦或麥角胺治療后，c-fos表達(dá)受到抑制[19-20]。因此，實(shí)驗(yàn)選擇采用ELISA測定給藥前后偏頭痛大鼠5-HT、CGRP、β-EP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS含量的變化，采用qPCR測定Calca、c-fos mRNA表達(dá)的變化，以評價XFDP抗偏頭痛的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，XFDP可升高偏頭痛大鼠5-HT、β-EP含量，降低CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS含量，降低Calca、c-fos mRNA的表達(dá)，而發(fā)揮治療偏頭痛的作用。XFDP通過調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)的表達(dá)發(fā)揮治療偏頭痛的作用[21]。

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（2020-04-18收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）