范景勝，熊朝瑞，俄木曲者，張 林，許 鋒

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

母羊繁殖性能是衡量肉羊生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo).通常以經(jīng)產(chǎn)母羊窩產(chǎn)羔數(shù)作為繁殖性狀的選擇指標(biāo)進(jìn)行表型選擇.但是，母羊的窩產(chǎn)羔數(shù)受到環(huán)境、營養(yǎng)調(diào)控、飼養(yǎng)管理水平等多種因素的影響，且產(chǎn)羔數(shù)為低遺傳力性狀，傳統(tǒng)的表型選擇選育進(jìn)展緩慢，效果不明顯.人們通過調(diào)控母羊發(fā)情期的排卵數(shù)，來對產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行間接選擇，也未取得突破性進(jìn)展.除母羊發(fā)情期的排卵數(shù)外，胚胎成活率、母羊子宮長度、胎盤效率等也是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的主要因素.胎盤效率(placental efficiency，PE)即胎盤提供營養(yǎng)物質(zhì)的效率，反應(yīng)胎盤運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的能力.1999年Wilson[1]等人最先在豬育種工作中提出這一概念，用出生仔豬窩重與胎盤重之比計(jì)算，并將其作為一種育種選擇指標(biāo).通過對豬[2-9]、綿羊[10-13]、山羊[14-15]胎盤效率與繁殖性狀關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，胎盤效率隨著母畜窩產(chǎn)仔(羔)數(shù)的增加，呈上升趨勢.

骨調(diào)素(Osteopontin，OPN)又稱骨橋蛋白，是一種具有多種生物活性的糖基化磷蛋白，最早由骨基質(zhì)中分離出來，后發(fā)現(xiàn)在血管、子宮、胎盤等組織中均有表達(dá)[16-17].在哺乳動物生殖系統(tǒng)中，骨調(diào)素參與精卵結(jié)合、受精卵著床、胎盤形成以及妊娠維持等過程[18]，是近年研究動物繁殖性狀的熱點(diǎn)之一.本試驗(yàn)以正在培育的肥羔型黑山羊?yàn)檠芯繉ο螅瑢钦{(diào)素基因外顯子6多態(tài)性進(jìn)行分析，并研究其與繁殖性狀之間的相關(guān)性，旨在為研究山羊繁殖性狀提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)選擇體況中等、健康無病的肥羔型黑山羊初產(chǎn)母羊52只、經(jīng)產(chǎn)母羊156只，共計(jì)208只繁殖母羊?yàn)檠芯繉ο?

1.2 引物設(shè)計(jì)

試驗(yàn)參考牛OPN基因DNA序列(GenBank登錄號:AY878328)和課題組前期研究得到的山羊OPN基因mRNA序列[19]設(shè)計(jì)肥羔型黑山羊OPN基因外顯子6的PCR擴(kuò)增引物(P1:5'-ACCCTGACACCCATTTT-3'，P2:5'-CAAGATTTACCTGAACG-3')，擴(kuò)增片段大小預(yù)計(jì)為350 bp左右.

1.3 試驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)在肥羔型黑山羊育種場開展，試驗(yàn)羊群營養(yǎng)供給和日常飼養(yǎng)管理，參照肥羔型黑山羊育種核心群進(jìn)行.母羊妊娠分娩后，記錄母羊產(chǎn)羔胎次、窩產(chǎn)羔數(shù)、出生窩重等，并收集產(chǎn)羔母羊胎盤，按照范景勝等[14]方法測定計(jì)算胎盤重量、子葉個數(shù)、子葉總重、胎盤效率、子葉密度和子葉均重等胎盤性狀指標(biāo).

分別對208只參試母羊頸靜脈采血，提取基因組DNA，并利用PCR-SSCP方法對OPN基因外顯子6進(jìn)行基因分型，計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)；并對不同基因型個體的繁殖性狀進(jìn)行比較分析，研究其多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 能繁母羊的繁殖性能與胎盤性狀

對208只參試母羊繁殖性能和胎盤性狀進(jìn)行了分析比較，詳見表1、表2.按照母羊不同產(chǎn)羔胎次進(jìn)行比較，結(jié)果顯示:初產(chǎn)母羊(52只)與經(jīng)產(chǎn)母羊(156只)的窩產(chǎn)羔數(shù)、出生窩重差異極顯著(p＜0.01)，羔羊平均初生重差異不顯著；產(chǎn)羔母羊的胎盤重量、子葉總重、子葉個數(shù)、子葉密度以及子葉均重，在不同產(chǎn)羔胎次間差異顯著或極顯著(p＜0.05或p＜0.01)，其中經(jīng)產(chǎn)母羊的胎盤重、子葉總重和子葉均重高于初產(chǎn)母羊，而子葉個數(shù)和密度，則低于初產(chǎn)母羊；經(jīng)產(chǎn)母羊的胎盤效率高于初產(chǎn)母羊，但差異不顯著.

表1 參試母羊繁殖性能及胎盤性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果(X-±SD)Table 1 Statistics of reproductive performance and placental traits of ewes(X-±SD)

表2 不同窩產(chǎn)羔數(shù)母羊胎盤性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果(±SD)Table 2 Statistics of placental traits of ewes with different litter size(±SD)

表2 不同窩產(chǎn)羔數(shù)母羊胎盤性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果(±SD)Table 2 Statistics of placental traits of ewes with different litter size(±SD)

Ⅰ組(52只) Ⅱ組(97只) Ⅲ組(59只)出生窩重/g 2401.48±89.71A 4671.33±93.28B 7125.42±85.42C羔羊初生均重/g 2401.48±89.71 2335.67±91.32 2302.56±89.21胎盤重量/g 269.31±45.66A 472.89±53.17B 632.44±68.01C子葉總重/g 139.72±1.68aA 267.87±1.23bB 307.44±1.03cB子葉個數(shù)/個 119.28±17.34a 101.31±15.36b 90.03±13.02c子葉均重/g 1.17±0.42a 2.64±0.36b 3.41±0.54c子葉密度 0.44±0.04aA 0.21±0.04bB 0.14±0.03cB胎盤效率 8.92±0.87 9.88±0.55 11.27±0.61

按照不同母羊窩產(chǎn)羔數(shù)(即產(chǎn)羔類型)，可將參試母羊分為單羔(Ⅰ組)、雙羔(Ⅱ組)和多羔(Ⅲ組)3個組別.對3個組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示:隨著窩產(chǎn)羔數(shù)的增加，羔羊出生窩重增加，差異極顯著(p＜0.01)，但羔羊初生均重差異不顯著；隨著窩產(chǎn)羔數(shù)的變化，母羊的胎盤重量、子葉總重、子葉個數(shù)、子葉密度以及子葉均重，呈顯著或極顯著(p＜0.05或p＜0.01)增加或降低趨勢，其中胎盤子葉密度隨窩產(chǎn)羔數(shù)的增加而降低，單羔組極顯著高于雙羔和多羔組；不同組別間母羊胎盤效率隨窩產(chǎn)羔數(shù)的增加而提高，但差異不顯著.

2.2 骨調(diào)素基因外顯子6的PCR-SSCP基因分型

通過對208只參試母羊骨調(diào)素基因外顯子6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型，電泳結(jié)果顯示:有三種帶型，分別定義為AA、AB、BB型.根據(jù)基因分型結(jié)果，隨機(jī)選擇基因型為AA、BB型個體樣本各5個，分別將相同基因型個體的OPN基因外顯子6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，進(jìn)行克隆測序.結(jié)果顯示:PCR擴(kuò)增基因片段的長度為348 bp，OPN基因外顯子6位于擴(kuò)增片段的39～338 bp.對不同基因型擴(kuò)增片段的測序序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)存在兩個突變位點(diǎn)，分別位于OPN基因外顯子6第69 bp(即擴(kuò)增片段的第107 bp)處的G/C顛換和第84 bp(即擴(kuò)增片段的第123 bp)處的A/G轉(zhuǎn)換.其中AA型樣本的第69 bp處為C、84 bp處為G，而BB型樣本對應(yīng)位點(diǎn)則分別為G、A(詳見圖1).OPN基因外顯子6第69 bp處C→G顛換，使氨基酸序列第97位氨基酸發(fā)生改變，由絲氨酸(Serine，Ser，羥基類)突變成精氨酸(Arginine，Arg，堿性氨基酸類)；第84 bp處G→A轉(zhuǎn)換，使氨基酸序列第103位氨基酸發(fā)生改變，由天冬氨酸(Aspartic acid，Asp，酸性氨基酸類)突變成天冬酰胺(Asparagine，Asn，酰胺類).

圖1 OPN基因外顯子6不同基因型序列比對陰影部分表示OPN基因外顯子6片段；加粗字體表示突變位點(diǎn)Fig.1 Alignment of sequence of different genotypes in exon 6 of OPN geneThe shaded part represents the exon 6 segment of OPN gene，the bold font indicates the mutation site

2.3 骨調(diào)素基因外顯子6遺傳多樣性

對參試母羊的骨調(diào)素基因外顯子6PCR-SSCP基因分型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示:208只參試母羊中，AA型個體有76只，AB型83只，BB型49只.外顯子6基因型頻率和等位基因頻率詳見表3.對參試羊群OPN基因外顯子6進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示該基因在肥羔型黑山羊群體中未處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(p＜0.01).肥羔型黑山羊培育已經(jīng)過了四個世代的選育，持續(xù)的人工選擇可能導(dǎo)致該基因位點(diǎn)上偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài).

表3 OPN基因外顯子6基因型頻率和等位基因頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Genotype and allele frequencies of exon 6 of OPN gene

通過計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)，對參試羊群的OPN基因外顯子6遺傳變異情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:肥羔型黑山羊外顯子6的多態(tài)信息含量PIC值為中度多態(tài)(0.25＜PIC＜0.5)，表明在該位點(diǎn)有較大的選擇空間(詳見表4).在肥羔型黑山羊培育過程中，主要選擇指標(biāo)為早期生長性狀，繁殖性狀與其相比，選擇壓力相對較小.

表4 肥羔型黑山羊OPN基因外顯子6遺傳變異分析Table 4 Analysis of genetic variation in exon 6 of OPN gene of fat-lamb goats

2.4 山羊骨調(diào)素基因多態(tài)性與山羊繁殖性能的相關(guān)性

對不同基因型肥羔型黑山羊個體的繁殖性狀、胎盤性狀指標(biāo)差異，采用最小二乘方差分析法進(jìn)行分析，結(jié)果見表5.不同純合子基因型個體間的各項(xiàng)性狀指標(biāo)差異顯著(p＜0.05)，其中胎盤效率、胎盤重量、子葉總重、窩產(chǎn)羔數(shù)均為BB型＞AA型個體，而子葉密度則反之.表明山羊的胎盤性狀和窩產(chǎn)羔數(shù)受OPN基因外顯子6多態(tài)性影響顯著，該多態(tài)位點(diǎn)可能是影響山羊繁殖性能的分子標(biāo)記.此外，以基因型分組，不同組別間的各項(xiàng)性狀指標(biāo)比較，也可反映出隨著母羊窩產(chǎn)羔數(shù)的增加，胎盤效率呈上升趨勢.

表5 OPN基因外顯子6不同基因型繁殖母羊繁殖性狀最小二乘均數(shù)Table 5 Least square means for reproductive traits ofewes with different genotypes in exon 6 of OPN gene

3 討論

Wilons等[1]于1999年首次研究發(fā)現(xiàn)母豬的窩產(chǎn)仔數(shù)與胎盤效率呈正相關(guān)關(guān)系，并將其作為選擇指標(biāo)，并應(yīng)用于豬的育種.山羊、綿羊均為子葉型胎盤，母體和胎兒之間通過子葉傳遞營養(yǎng)物質(zhì).本試驗(yàn)對208只肥羔型黑山羊能繁母羊的胎盤性狀進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn):肥羔型黑山羊的胎盤重量、子葉總重量等指標(biāo)，經(jīng)產(chǎn)母羊均高于初產(chǎn)母羊，而子葉數(shù)量、子葉密度則相反；母羊窩產(chǎn)羔數(shù)增加，其胎盤效率隨之提高，而子葉密度則隨之降低.這與國內(nèi)外在綿羊、山羊方面的有關(guān)研究結(jié)果基本一致[12-15，20]，均證實(shí)了妊娠母羊是通過增大胎盤子葉的重量來提升胎盤效率，從而保障胎兒的營養(yǎng)供給[21].

骨調(diào)素在哺乳動物生殖系統(tǒng)中，受孕激素的調(diào)控，并參與調(diào)控“子宮—胎盤”微循環(huán)，在胚胎著床和妊娠維持過程中發(fā)揮作用.骨調(diào)素基因是近年關(guān)聯(lián)動物繁殖性狀的熱點(diǎn)候選基因之一.研究已經(jīng)證實(shí)豬骨調(diào)素基因啟動子區(qū)域、第6內(nèi)含子的多態(tài)性與其產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)仔成活率等繁殖性狀相關(guān)[22-23].但對于OPN基因外顯子多態(tài)性的研究報(bào)道較少.毛建文[20]研究發(fā)現(xiàn)，OPN基因外顯子7多態(tài)性顯著影響山羊的窩產(chǎn)羔數(shù)、胎盤效率.謝暢[14]以樂至黑山羊?yàn)檠芯繉ο?，對OPN基因部分外顯子多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，外顯子6存在SNP位點(diǎn)，但呈低度多態(tài)，未引起氨基酸結(jié)構(gòu)改變，且對母羊胎盤效率和繁殖性能的影響均不顯著.

本試驗(yàn)結(jié)果與謝暢的研究結(jié)果不同，在OPN基因外顯子6檢測到的第69 bp處存在G/C顛換、第84 bp處存在A/G轉(zhuǎn)換，均引起了氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變化；外顯子6基因多態(tài)性顯著影響肥羔型黑山羊胎盤性狀、窩產(chǎn)羔數(shù)等繁殖性狀.這可能與選擇的山羊品種不同有關(guān).樂至黑山羊經(jīng)產(chǎn)母羊產(chǎn)羔率達(dá)到250%以上，長期的自然選擇使OPN基因外顯子6在該群體中相對保守.肥羔型黑山羊經(jīng)產(chǎn)母羊產(chǎn)羔率為213%左右.該群體培育過程中，對繁殖性狀的育種選擇壓力較小，OPN基因外顯子該6還有較大的選擇空間，表明肥羔型黑山羊的繁殖性能通過加強(qiáng)選育，還可以進(jìn)一步提升.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對208只肥羔型山羊能繁母羊的胎盤性狀研究分析發(fā)現(xiàn)，母羊的胎盤效率隨著窩產(chǎn)羔數(shù)的增加而提高，子葉密度隨窩產(chǎn)羔數(shù)的增加而降低；OPN基因外顯子6多態(tài)性顯著影響山羊的繁殖性狀.但山羊的繁殖性狀受環(huán)境、飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)水平等非遺傳因素的影響較大，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究.