鄭玉才，于 淼，金素鈺，黃 林

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

藏系綿羊(Ovis aries)是中國青藏高原地區(qū)的重要家畜之一，基于外貌特征、生產(chǎn)性能可分為三種類型，包括高原型、山谷型和山地型[1].其中，高原型藏系綿羊的比例較高，其毛纖維質(zhì)量好，是生產(chǎn)羊毛制品的優(yōu)質(zhì)原料[2].目前，有關(guān)高原型藏系綿羊絨毛生產(chǎn)性能已有一些報道[3]，但對其絨毛性狀的分子基礎(chǔ)研究尚不多.研究藏系綿羊絨毛性狀相關(guān)基因可為其選育提供科學(xué)依據(jù)，具有重要意義.

本實驗以Hh(Hedgehog)信號通路為切入點，該通路是調(diào)控機體發(fā)育的一種重要通路[4]，與毛囊發(fā)育相關(guān).脊椎動物中Hh蛋白含有3種異構(gòu)體(Dhh、Ihh和Shh)，其中Shh為該家族中唯一能在毛囊中表達(dá)的成員，是Shh信號通路的重要成員，在毛囊發(fā)育中有關(guān)鍵作用[5-6].Smoothened(Smo)基因編碼的Smo蛋白是一種G蛋白偶聯(lián)受體，作為Shh信號通路中的受體之一而發(fā)揮重要作用[7].Smo基因的序列較保守，小鼠、人和綿羊Smo基因的編碼區(qū)長度均在2 kb左右.目前GenBank中綿羊Smo基因僅有預(yù)測序列(XM_012131455.2)，編碼區(qū)長度2 342 bp，編碼779個氨基酸.本研究設(shè)想Smo基因可影響Hh通路中的下游基因表達(dá)，影響藏系綿羊毛囊細(xì)胞的功能.本研究通過構(gòu)建高原型藏系綿羊Smo基因的皮膚特異表達(dá)載體和干擾載體，通過轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人內(nèi)根鞘細(xì)胞，檢測該基因?qū)h通路下游靶基因(Gli1和Gsk3β)mRNA水平的影響，闡明該基因細(xì)胞水平的調(diào)控機制.

1 材料與方法

1.1 皮膚樣品采集

樣品采集于9月份.在四川省都江堰市郊區(qū)一個屠宰場，選取成年健康的高山型藏系綿羊(Ovis aries)母羊共5只，在屠宰30 min內(nèi)采集腹部皮膚，剃除皮膚被毛后用液氮罐運送回實驗室.樣品于液氮中保存.

1.2 試劑及儀器

PfuDNA高保真聚合酶(Novoprotein公司)，TaKa-Ra LA Taq with GC Buffer(TaKaRa公司)，Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo公司)，Lipofectamine 3000 Transfection Reagent(Invitrogen公司)，PCR一步定向克隆試劑盒(Novoprotein公司)，BLOCK-iT PolⅡmiR RNAi Expression Vector Kit(ThermoFisher公司)，pCDsRed2-KI真核載體為內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉東軍教授惠贈，載體中有KAP6.1啟動子、CMV啟動子、紅色熒光蛋白及Kan/neo抗性基因.IX71S8F型倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)，CFX 96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司).

1.3 Smo基因克隆測序

用Trizol試劑提取5只藏系綿羊的皮膚總RNA，并用核酸蛋白檢測儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和質(zhì)量.將1μg混合總RNA按PrimeScript RT-PCR kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄為cDNA.

根據(jù)普通綿羊Smo基因的3個預(yù)測序列(XM_012131455.2、XM_012131456.2和XM_015095115.1)、小鼠和人的Smo基因序列(NM_176996、NM_005631)，設(shè)計擴增藏系綿羊Smo基因的PCR引物(Smo-F:5′-TCTGCTGAGTTGGCGGGTTTG-3′，Smo-R:5′-TCCTTTCGTTGCAGGTCCTACTC-3′)，預(yù)期產(chǎn)物長度2397 bp.PCR條件:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸3 min，共40個循環(huán)；72℃延伸5 min.25μL的PCR體系含0.5μL的cDNA、0.25μL的TaKaRa LA Taq.擴增產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收后連接pMD-19T載體、轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α、進(jìn)行陽性克隆的篩選，通過菌液PCR驗證后，取5個陽性克隆(pMD19-Smo)由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序.結(jié)果用DNAMAN Version 6進(jìn)行分析，并與綿羊、山羊和人的Smo基因序列比對.

1.4 皮膚特異表達(dá)載體pCDsRed2-KS構(gòu)建

比對藏系綿羊Smo基因CDS區(qū)序列與pCDsRed2-KI序列，設(shè)計包含SalⅠ和KpnⅠ雙酶切位點的PCR引物，具體如下:

F:5'-CCTCCTAGAGCAATCGTCGACTCTGCTGAGTTGGCGGGTTT-3'

R:5'-ATAACGCAGGAAAGAGGTACCTCAGAAG TCGGAGTCTGCATC-3'

序列中單下劃線部分為載體序列，雙下劃線部分依次為SalⅠ和KpnⅠ酶切序列.預(yù)期擴增長度為2 387 bp.以上述包含藏系綿羊Smo基因的陽性克隆菌液為模板，用高保真PfuDNA聚合酶擴增Smo基因CDS區(qū)，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后進(jìn)行目的片段膠回收，進(jìn)而與pCDsRed2載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α、篩選陽性克隆.對陽性克隆用上述引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，再進(jìn)一步提取重組質(zhì)粒進(jìn)行SalⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定.選取4個經(jīng)鑒定的陽性克隆進(jìn)行雙向測序.

1.5 Smo基因干擾載體構(gòu)建

用軟件(www.invitrogen.com/rnai，Invitrogen公司)根據(jù)藏系綿羊、人Smo的基因序列(NM_005631)，確定針對藏系綿羊Smo基因CDS保守區(qū)的3個長度均為21 bp干擾靶序列:靶序列1為5′-CATCATCTTTGTCATCGTGTA-3′，靶序列2為5′-CCATCCCTGACTGTGAGATCA-3′，靶序列3為5′-ATGAGGTGCAGAACATCAAGT-3′，幾個序列分別在藏系綿羊Smo基因的533 bp、945 bp和1508 bp處.按線性化pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體粘性末端序列和miR-155的結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計3對長度為64 bp互補核苷酸序列(圖1中的Top strand和Bottom strand)，此為用于干擾的前體miRNA(pre-miRNA)，按BLOCK-iT PolⅡmiR RNAi Expression Vector Kit的說明，分別退火形成雙鏈，稀釋后連入該試劑盒提供的線性載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α、篩選陽性克隆.3個干擾載體中前體miRNA序列的上游有1個正向引物序列(編碼綠色熒光蛋白)，下游有1個反向引物序列，二者分別為:EmGFP-F:5′-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3′、miRNA-R:5′-CTCTAGATCAACCACTTTGT-3′，PCR產(chǎn)物預(yù)期長度280 bp.用這對引物對篩選的陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，然后將各干擾載體陽性克隆菌液分別送3個進(jìn)行雙向測序.序列正確的克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)后，分別用小提質(zhì)粒試劑盒提取干擾載體.

圖1 前體miRNA核苷酸序列Fig.1 Sequence of pre-miRNA

A、B、C分別是與Smo基因靶序列1、2和3對應(yīng)的前體miRNA序列；Top Strand表示質(zhì)粒外側(cè)鏈序列，Bottom Strand表示與Top Strand互補同時連接質(zhì)粒內(nèi)側(cè)鏈的序列；Linker為連接載體粘性末端的序列，Mature miR RNAi Sequence為成熟的miRNA干擾序列，Loop Sequence為前體miRNA未配對的序列，Target Sequence為靶序列.

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及基因檢測

人內(nèi)根鞘細(xì)胞培養(yǎng)采用6孔板，包括空白組:不加質(zhì)粒；超表達(dá)組:轉(zhuǎn)染pCDsRED2-KS；干擾組:轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRⅠ-Ⅲ，每組重復(fù)3孔.按每孔約5×106個內(nèi)根鞘細(xì)胞接種(每組的細(xì)胞傳代數(shù)相同)，加3 mL間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞至80%～90%匯合.在轉(zhuǎn)染前加入1.5 mL的opti-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后，用脂質(zhì)體分別將表達(dá)載體pCDsRed2-KS和3個干擾載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRⅠ-Ⅲ瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h后替換為無雙抗的含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液3 mL，開始統(tǒng)計轉(zhuǎn)染效率并繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA.

細(xì)胞總RNA經(jīng)質(zhì)量、濃度檢測后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用定量PCR檢測Smo、Gli1、GSK3β基因及內(nèi)參基因GAPDH的mRNA水平.定量PCR引物均參照Gen-Bank中人、綿羊相應(yīng)基因的保守區(qū)設(shè)計(表1).定量PCR條件:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，55℃～60℃(具體為表1中的退火溫度)20 s，72℃15 s；共40個循環(huán).65℃～95℃制作溶解曲線.每個樣品做重復(fù).定量PCR的模板和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作采用的常規(guī)方法.

表1 定量PCR引物信息Table 1 Information of quantitative PCR primers

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)用平均值±SD表示，獲得的定量PCR數(shù)據(jù)用2-△△Ct方法分析基因的相對表達(dá)水平[8].3個基因的mRNA相對水平用SPSS18.0進(jìn)行單變量方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05和P＜0.01分別表示差異顯著和極顯著.

2 結(jié)果

2.1 藏系綿羊Smo基因的克隆測序

取藏系綿羊皮膚混合總RNA(1μg)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用克隆PCR引物進(jìn)行擴增，產(chǎn)物大小為2 000～4 000 bp(圖2，)，再通過常規(guī)的基因克隆方法獲得pMD19-Smo.測序表明藏系綿羊Smo長度為2 397 bp，CDS長度與普通綿羊Smo基因的預(yù)測序列(XM_012131455.2)相同，為2 342 bp，序列相似性達(dá)99.87%，編碼779個氨基酸，兩者僅相差3個堿基，其中1個導(dǎo)致692位丙氨酸變成絲氨酸.藏系綿羊與人Smo基因序列(NM_005631)的相似性約為90%；與預(yù)測的山羊Smo基因CDS序列(XM_018046943.1)長度一致，相似性為99.32 %，它們編碼的氨基酸相似性為99.62 %.這提示Smo基因序列在進(jìn)化上具有保守性.

圖2 藏系綿羊Smo基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis of PCR product amplifying Tibetan sheep Smo geneM.DNA Marker DL10000，S.藏系綿羊Smo基因

2.2 藏系綿羊Smo基因皮膚特異表達(dá)載體構(gòu)建

用含SalⅠ、KpnⅠ兩個酶切位點的PCR引物，對含有pMD19-Smo基因的菌液進(jìn)行擴增(圖3A)，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期相符(2 387 bp)，表明獲得了含雙酶切位點的Smo基因片段.用此片段構(gòu)建了含藏系綿羊Smo基因的皮膚特異表達(dá)載體pCDsRed2-KS，全長8 387 bp(圖3B)，陽性克隆經(jīng)菌液PCR鑒定以及質(zhì)粒的雙酶切驗證.進(jìn)一步測序表明該載體中的藏系綿羊Smo基因CDS區(qū)核苷酸序列無突變.

圖3 含酶切位點PCR引物擴增Smo基因和pCDsRed2-KS載體的電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of amplified products of Smo gene using PCR primers with digestion sites and vector pCDsRed2-KS

M為Marker(bp)；A為Smo基因PCR產(chǎn)物；B顯示pCDsRed2-KS構(gòu)建，其中泳道1為pCDsRed2-KI載體SalⅠ和KpnⅠ雙酶切產(chǎn)物，泳道2為構(gòu)建的pCDsRed2-KS載體.

2.3 靶向藏系綿羊Smo基因的干擾載體構(gòu)建

試驗設(shè)計的3對干擾序列經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后，陽性克隆的菌液PCR顯示產(chǎn)物長度與預(yù)期長度(280 bp)相符(圖4).將干擾載體測序后表明，插入的片段與設(shè)計的64 bp核苷酸干擾序列完全相同，插入方向正確.表明設(shè)計合成的干擾序列已連入pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR載體.

圖4 藏系綿羊干擾載體菌液PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of bacterial liquid PCR products of interference vectors of Tibetan sheepM.DNA Marker DL2000(bp)，1～3分別為pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miRⅠ～Ⅲ菌液PCR產(chǎn)物.

2.4 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及基因表達(dá)分析

體外培養(yǎng)的人內(nèi)根鞘細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)載體、干擾載體48 h后，用普通顯微鏡、熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率均在約40%(圖5).

圖5 內(nèi)根鞘細(xì)胞轉(zhuǎn)染(100×)Fig.5 Cell transfection of HHIRSC

本研究建立了Smo、Gli1、GSK3β和GAPDH基因的定量PCR分析方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好(R2≥0.991)，擴增效率高(E≥91%).結(jié)果顯示:pCDsRed2-KS超表達(dá)組中Smo、Gli1、GSK3β基因mRNA水平均極顯著高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對照組(P＜0.01)，相差分別約5 900倍、95倍和20倍；轉(zhuǎn)染了3個干擾載體pcDNA-miRⅠ、Ⅱ、Ⅲ的實驗組，對Smo基因沉默效率分別約為98%、99%和98%，且Smo、Gli1和GSK3β基因mRNA水平極均顯著低于對照組(圖6，P＜0.01).

圖6干擾載體對體外培養(yǎng)的人毛囊內(nèi)根鞘細(xì)胞中3個基因mRNA水平的影響Fig.6 mRNA levels of three genes in cultured HHIRSC transfected with interfering vectors

3 討論

Smo蛋白是細(xì)胞膜上一種典型的G蛋白偶聯(lián)受體，作為Hh通路中的一種受體在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7，9]，可激活下游的配體Gli家族成員，后者作為Hh通路的最終轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促使靶基因轉(zhuǎn)錄[10].本研究首次從藏系綿羊皮膚中克隆了Smo基因的編碼區(qū)序列，為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ).藏系綿羊Smo基因與普通綿羊Smo基因預(yù)測序列(XM_012131455.2)高度相似，相差的3個堿基中僅有1個為錯義突變，但突變的氨基酸(692位丙氨酸變成絲氨酸)性質(zhì)差異不大，推測不會對Smo蛋白的功能有影響.因此，藏系綿羊與普通綿羊Smo蛋白在性質(zhì)、功能等方面可能相近.藏系綿羊Smo基因的研究對闡明Hh通路在毛囊中的作用有理論價值[5-6]，而相關(guān)研究在綿羊上報道少.動物毛囊是具有周期性的器官，一個周期包括生長期、退行期和休止期.毛囊發(fā)育一直是家畜絨毛性狀研究的熱點.有研究表明，Shh通路對于胚胎毛囊形態(tài)發(fā)生是必需的[10].

基因的超表達(dá)和干擾是當(dāng)前研究其功能的重要手段.本研究成功構(gòu)建了藏系綿羊Smo基因的皮膚特異表達(dá)載體和干擾載體，可分別正向和負(fù)向調(diào)控Smo基因的表達(dá).試驗采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000試劑將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的內(nèi)根鞘細(xì)胞，獲得約40%的轉(zhuǎn)染效率，無需再進(jìn)行細(xì)胞篩選即可檢測轉(zhuǎn)染前后基因表達(dá)變化.另外，本研究中細(xì)胞轉(zhuǎn)染時間增加到24 h，推測這可能有助于提高轉(zhuǎn)染效率.試驗中表達(dá)載體轉(zhuǎn)染內(nèi)根鞘細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中的Smo、Gli1、GSK3β基因mRNA水平均極顯著增加，顯示了它們在表達(dá)上的關(guān)聯(lián).配體Gli1是Hh信號通路最終的效應(yīng)物[4]，可反映該通路的活性，因此，通過調(diào)控Smo基因的表達(dá)，有望借助Hh信號通路而影響藏系綿羊毛囊細(xì)胞的功能.

miRNA是細(xì)胞內(nèi)源性非編碼小RNAs，參與基因表達(dá)的調(diào)控，具有結(jié)合mRNA導(dǎo)致相應(yīng)基因沉默的作用[11-13].研究表明，miR-326就可抑制Smo和Gli基因的表達(dá)[14].在哺乳動物中約60%的編碼蛋白質(zhì)的基因受miRNA的調(diào)控[15]，因此，利用miRNA干擾基因表達(dá)是研究基因功能的重要方法.本試驗設(shè)計合成了3個特異識別藏系綿羊Smo基因mRNA的前體miRNA互補序列，采用pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR載體，構(gòu)建了干擾效率高的載體，在細(xì)胞中可合成特異的miRNA而影響基因表達(dá).本試驗表明，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人內(nèi)根鞘細(xì)胞后，Smo基因的mRNA水平極顯著降低，同時，Gli1、GSK3β基因的mRNA水平亦極顯著下降(圖6)，說明本實驗構(gòu)建的藏系綿羊Smo基因3個干擾載體均是有效的，并且，內(nèi)根鞘細(xì)胞中Gli1、GSK3β基因與Smo基因mRNA水平相關(guān).深入分析Hh信號通路中諸多基因的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，是開展毛囊發(fā)育調(diào)控的基礎(chǔ).