謝瑞龍，梁建英

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑因具有廣譜、高效、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的蟲害防治過(guò)程中。但由于這些農(nóng)藥的不合理使用，不但對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破環(huán)，藥物殘留還直接威脅到人類的身體健康[1-2]。 根據(jù)作用機(jī)制，這2 類農(nóng)藥會(huì)抑制動(dòng)物或人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性，造成乙酰膽堿不斷累積，影響其正常傳導(dǎo)，導(dǎo)致中毒現(xiàn)象的發(fā)生；若在人體內(nèi)長(zhǎng)期蓄積還會(huì)致畸、致癌、致突變，甚至死亡[3-5]。

豆乳作為植物乳的一種，因其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，有助于調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、更年期綜合征以及心血管疾病等，所以越來(lái)越受到消費(fèi)者 喜愛[6-7]。目前，豆乳中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)方法少有文獻(xiàn)研究，而植物源性食品的檢測(cè)方法有酶抑制法[8]、酶聯(lián)免疫法[9]、氣相色譜法[10-11]、液相色 譜法[12-13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14-15]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS） 法[16-17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-19]等。其中，GC-MS/MS法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，是多種農(nóng)藥殘留定量分析的主要手段。為了保障豆乳產(chǎn)品的質(zhì)量安全，避免受到農(nóng)藥殘留污染的風(fēng)險(xiǎn)，本研究利用QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）的前處理方法，通過(guò)優(yōu)化關(guān)鍵步驟，建立一種GC-MS/MS同時(shí)測(cè)定豆乳中12 種常見有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的方法。這將為其他植物乳中農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆乳樣品：植選濃香豆乳、植選植物乳、植選濃香豆乳（黑芝麻、黑豆） 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物（檸檬酸氫二鈉）、醋酸鈉（均為分析純） 美國(guó)安捷倫科技有限公司；乙酸乙酯（色譜純）、乙腈（農(nóng)殘級(jí)）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑、含12 種農(nóng)藥（溴硫磷、三硫磷、毒蟲畏、毒死蜱、甲基毒死蜱、蠅毒磷、甲基嘧啶磷、仲丁威、苯硫威、異丙威、抗蚜威、殘殺威）的混標(biāo)（100 μg/mL）、環(huán)氧七氯B（內(nèi)標(biāo)，1 mg/mL） 上海 安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TQS9000氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電子轟擊離子源） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Biofuge Stratos低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；分析天平（感量0.000 1 g） 瑞士Mettler Toledo公司；TurboVap LV氮吹儀 瑞典Biotage公司；KS501渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10.0 g豆乳樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min；然后在冷水浴條件下加入4.0 g MgSO4、1.0 g氯化鈉、1.0 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉后，繼續(xù)振蕩5 min，4 ℃、4 200 r/min離心5 min；取7.0 mL上清液有機(jī)層至內(nèi)含1 200 mg MgSO4、400 mg PSA和400 mg C18的15 mL離心管中，振蕩5 min，4 ℃、4 200 r/min離心5 min；取4.0 mL上清液至氮吹管中，40 ℃氮吹至近干；加入20 μL 5 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，乙酸乙酯復(fù)溶至1.0 mL，過(guò)濾后供GC-MS/MS測(cè)定分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方式，稱取不含待測(cè)農(nóng)藥的樣品按上述操作制備樣品空白提取液，空白基質(zhì)溶液氮?dú)獯蹈珊螅尤?0 μL 5 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，依次加入一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，用乙酸乙酯稀釋定容至1.0 mL，配制成質(zhì)量濃度梯度為5、10、20、50、100、150、200 ng/mL的12 種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：5%苯基-甲基聚硅氧烷石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃/min升溫至90 ℃，并保持1.5 min，以25 ℃/min升溫至180 ℃，以5 ℃/min升溫至280 ℃，以10 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離方式：電子轟擊源；電離能量70 eV；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲6 min；監(jiān)測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，12 種農(nóng)藥及環(huán)氧七氯B的保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和碰撞電壓參見表1。

1.3.5 結(jié)果計(jì)算

12 種農(nóng)藥的含量計(jì)算公式如下。

式中：X為試樣中被測(cè)組分殘留量/（mg/kg）；ρ為由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的被測(cè)組分質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V為樣品溶液定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g；n為稀釋倍數(shù)；1 000為換算系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Tracefinder 4.1軟件處理標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到被測(cè)組分質(zhì)量濃度；使用WPS Office 2020軟件繪制簇狀柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的確定

為了選擇合理的前處理方法，本研究參照植物源性食品基質(zhì)，對(duì)GC法和GC-MS法測(cè)定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行總結(jié)。由表2可知，總體而言，前處理方法可分為液-液萃取、固相萃取柱及分散固相萃取3 種方式。其中，GB/T 5009.145—2003《植物性食品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多種殘留的測(cè)定》[11]的前處理步驟采用丙酮水溶液提取，二氯甲烷二次提取，硅膠柱凈化，最后濃縮定容。該方法的實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，且需要消耗大量有機(jī)試劑，對(duì)環(huán)境及人員危害較大。NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》[20]為多個(gè)方法的合集，對(duì)于有機(jī)磷類農(nóng)藥，采用液-液萃取，乙腈提取，過(guò)濾濃縮后定容；對(duì)于氨基甲酸酯農(nóng)藥，采用乙腈提取，經(jīng)氨基柱凈化，氮吹復(fù)溶上樣。該方法操作較麻煩，需要在80 ℃水浴條件下加熱濃縮，且樣品凈化不夠充分，不適用于復(fù)雜的樣品基質(zhì)，不利于儀器長(zhǎng)時(shí)間使用。對(duì)于DB34/T 1076—2009《蔬菜、水果、糧食、茶葉中40 種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留同時(shí)測(cè)定方法 氣相色譜法》[21]和GB 23200.8—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水果和蔬菜中500 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[22]，前處理有了明顯改進(jìn)，采用乙腈提取-固相萃取柱凈化的前處理方法，溶劑的使用量及操作步驟部分減少。GB 23200.113—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》[16]中除提供了乙腈提取-石墨化炭黑/氨基復(fù)合柱凈化的方法外，還推薦了QuEChERS前處理方法。研究表明，QuEChERS整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單、試劑用量少、環(huán)境污染小、處理時(shí)間短[23]。綜上所示，結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作，本研究最終確定采用QuEChERS前處理法。

2.2 萃取步驟中降溫方式的選擇

QuEChERS法提取時(shí)會(huì)加入MgSO4，可以更好地促使水相與有機(jī)相分層。然而MgSO4遇水會(huì)放出大量的熱，容易導(dǎo)致部分農(nóng)藥分解，最終影響目標(biāo)物的提取效率。為了避免這一問題的發(fā)生，本研究采用水傳導(dǎo)散熱的原理，快速釋放MgSO4遇水產(chǎn)生的熱量，降低實(shí)驗(yàn)體系的溫度。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)流程為在冷水浴條件下向離心管中加入鹽包。

將冷水浴降溫與傳統(tǒng)方式（常溫實(shí)驗(yàn)環(huán)境）降溫進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，每組做3 次平行。由圖1可知，2 種降溫方式的平均加標(biāo)回收率分別為82.3%～97.6%和67.0%～85.8%；在冷水浴條件下，所有目標(biāo)物的平均加標(biāo)回收率優(yōu)于傳統(tǒng)方式處理，其中異丙威效果最明顯，其平均加標(biāo)回收率提升15.3%。因此，本研究選擇在冷水浴條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 2 種降溫方式對(duì)12 種農(nóng)藥平均加標(biāo)回收率的影響 （加標(biāo)量0.004 mg/kg）Fig. 1 Effect of two cooling methods on average recoveries of 12 pesticides at spiked concentration of 0.004 mg/kg

2.3 凈化步驟中凈化包的選擇

為了確定合適的QuEChERS凈化包，結(jié)合國(guó)標(biāo) GB 23200.113—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》中蔬菜、水果及谷物的前處理實(shí)驗(yàn)，以及其他文獻(xiàn)調(diào)研的結(jié)果[16,24]，本研究選取2 組通用型的凈化填料進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)：第1組為1 200 mg MgSO4、400 mg PSA和400 mg C18；第2組為885 mg MgSO4、150 mg PSA和15 mg GCB，每組做3 次平行。

由圖2可知，2 組實(shí)驗(yàn)的平均加標(biāo)回收率分別為87.7%～99.9%和76.4%～110.3%，除溴硫磷、蠅毒磷及殘殺威外，其余9 種目標(biāo)物在MgSO4＋PSA＋C18條件下凈化，平均加標(biāo)回收率更優(yōu)。因此，本研究選擇通用型凈化包1 200 mg MgSO4、400 mg PSA和400 mg C18。

圖2 2 種凈化包對(duì)12 種農(nóng)藥平均加標(biāo)回收率的影響 （加標(biāo)量0.004 mg/kg）Fig. 2 Effect of two dispersive solid phase extraction kits on average recoveries of 12 pesticides at spiked concentration of 0.004 mg/kg

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

本研究采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣后采集數(shù)據(jù)，以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)峰面積比值為縱坐標(biāo)，二者之間的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由表3可知，在5～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，12 種有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。12 種農(nóng)藥的定量限均為 0.004 mg/kg，滿足信噪比（RS/N）≥10的要求。

表3 12 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限Table3 Calibration curves and LOQs for 12 pesticides

2.5 方法回收率和精密度

選擇空白豆乳樣品進(jìn)行0.004、0.008、0.040 mg/kg 3 個(gè)不同水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平均做6 次平行，測(cè)定加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表4可知，12 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為71.8%～114.9%，RSD為4.6%～13.3%，說(shuō)明該方法滿足要求，適用于豆乳中目標(biāo)農(nóng)藥殘留的測(cè)定。在實(shí)際樣品檢測(cè)中，利用所建立的方法對(duì)市售的5 批次豆乳進(jìn)行12 種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)，結(jié)果均未檢出。

表4 12 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及RSD（n＝ 6）Table4 Recoveries and RSDs for 12 pesticides (n = 6)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

隨機(jī)抽取3 種常見豆乳產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，分別稱取10 g植選濃香豆乳、植選植物乳、植選濃香豆乳（黑芝麻、黑豆），按照方法操作步驟進(jìn)行12 種農(nóng)藥殘留檢測(cè)，結(jié)果均未檢出，與樣品實(shí)際情況相符，表明此方法適用。

3 結(jié) 論

本研究提供了一種同時(shí)測(cè)定豆乳中12 種有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的GC-MS/MS方法。在其他食品基質(zhì)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用QuEChERS前處理方法，在提取步驟中引入冷水浴降溫方式，較好地提升了目標(biāo)物的加標(biāo)回收率；在凈化步驟中對(duì)通用型凈化包進(jìn)行了加標(biāo)回收率對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確定了合適比例的凈化包；同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：12 種農(nóng)藥的定量限均為0.004 mg/kg，3 個(gè)不同添加水平下的加標(biāo)回收率為71.8%～114.9%，RSD為4.6%～13.3%，加標(biāo)回收率和精密度滿足要求。該方法具有快速、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，適用于豆乳中有機(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的測(cè)定，也可為其他植物乳中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的研究及應(yīng)用提供參考。