楊 玲，張 棟，齊世華，馬新穎，周帥康，艾連中，王世杰,

（1.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800；2.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050221； 3.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；4.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

雙歧桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)最重要的益生菌之一，對(duì)維持宿主健康起著重要作用[1]。研究表明，雙歧桿菌具有抗衰老[2-4]、提高免疫力[5-6]、抗感染[7-9]、改善腸道 功能[10-12]和腦部功能[13-15]等功效。

兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterim bifidum）TMC3115是一株分離自人體的益生菌，具有調(diào)節(jié)代謝、抗過(guò)敏等功效[16-20]。然而，我國(guó)益生菌產(chǎn)業(yè)起步較晚，雙歧桿菌的生產(chǎn)技術(shù)與發(fā)達(dá)國(guó)家存在差距，限制了我國(guó)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時(shí)雙歧桿菌本身的厭氧特性也造成了其菌粉生產(chǎn)難度較大。因此，研究?jī)善珉p歧桿菌關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)成為突破益生菌產(chǎn)業(yè)瓶頸的關(guān)鍵。本研究針對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115的初始發(fā)酵條件、培養(yǎng)基配方、凍干保護(hù)劑及凍干工藝進(jìn)行篩選與優(yōu)化，并將試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩歧雙歧桿菌TMC3115由河北一然生物科技有限公司菌種保藏中心提供，分離自健康嬰兒腸道。

葡萄糖 山東西王藥業(yè)有限公司；乳糖 江蘇長(zhǎng)晶生物工程有限公司；蔗糖 廣西田林和平糖業(yè)有限 公司；大豆蛋白胨、牛骨蛋白胨 山東玉寶生物科技股份有限公司；酪蛋白胨 北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；胰酪蛋白胨 山東偉多豐生物技術(shù)有限公司；酵母浸粉FM902、酵母浸粉FM808 安琪生物集團(tuán)有限公司；脫脂乳粉、乳清粉 新西蘭恒天然公司；海藻糖、谷氨酸鈉、谷氨酸、脯氨酸 梅花生物科技集團(tuán)股份有限 公司；抗壞血酸、抗壞血酸鈉、甘氨酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異D-抗壞血酸鈉、精氨酸 江蘇采薇生物科技有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽 深圳金富源生物科技有限公司；甘露醇、山梨醇 山東天力藥業(yè)有限公司；MRS培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；丙三醇 安徽千品生物科技有限公司；硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸氫二銨、無(wú)水乙酸鈉、磷酸氫二鉀 石家莊現(xiàn)代儀器儀表化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE28 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；722N可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；DL-CJ-2ND Ⅱ超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BPH-9272精密恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BLBIO-3GJ-4-H自動(dòng)發(fā)酵罐 上海百倫生物科技有限公司；GL-21M離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所有限公司；FD8-4凍干機(jī) 美國(guó)西盟國(guó)際集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的篩選及培養(yǎng)條件的確定

用于培養(yǎng)雙歧桿菌的改良MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分為：蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、無(wú)水乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、吐溫-80 1 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行碳源及氮源優(yōu)化。

1.3.1.1 碳源及氮源優(yōu)化

以MRS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用葡萄糖、乳糖、蔗糖替代碳源，添加量均為2%，分別于37 ℃培養(yǎng)16 h，測(cè)定發(fā)酵液的pH值、600 nm波長(zhǎng)處光密度（OD600nm）及活菌數(shù)，進(jìn)行碳源初篩。

使用大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛骨蛋白胨、胰酪蛋白胨、酵母浸粉FM902、酵母蛋白胨、酵母浸粉FM808替代氮源，添加量均為1%，分別于37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，測(cè)定發(fā)酵液的pH值、OD600nm及活菌數(shù)，進(jìn)行氮源初篩。

利用正交試驗(yàn)，將初篩中碳源和氮源中效果最好的組分進(jìn)行優(yōu)化組合，最終確定高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.1.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115生長(zhǎng)的影響

以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，初始pH值分別設(shè)定為6.4、6.8、7.0、7.2、7.4，分別于37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，測(cè)定發(fā)酵液pH值、OD600nm及活菌數(shù)。

1.3.1.3 接種量對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115生長(zhǎng)的影響

將兩歧雙歧桿菌TMC3115分別以2%、3%、4%、5%的接菌量接入改良培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，測(cè)定發(fā)酵液pH值、OD600nm及活菌數(shù)。

1.3.2 兩歧雙歧桿菌TMC3115發(fā)酵終止時(shí)間的確定

在最終確定的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115進(jìn)行發(fā)酵（37 ℃、24 h），分別在發(fā)酵0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h取發(fā)酵液，測(cè)定 pH值、OD600nm和活菌數(shù)，繪制最終的發(fā)酵曲線，確定發(fā)酵終止時(shí)間。

1.3.3 凍干保護(hù)劑的篩選

分別配制常用的復(fù)合類、多元醇類、糖類、氨基酸類、抗氧化劑類等共18 種不同的凍干保護(hù)劑（表1）溶液，在同一條件下凍干，分別檢測(cè)凍干存活率，再進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定凍干保護(hù)劑配方。

表1 實(shí)驗(yàn)所用不同種類凍干保護(hù)劑Table1 List of cryoprotectants tested in this study

凍干存活率按下式計(jì)算。

式中：n1為乳化液活菌數(shù)/（CFU/g）；m1為乳化 液質(zhì)量/g；n2為凍干粉活菌數(shù)/（CFU/g）；m2為凍干粉質(zhì)量/g。乳化液指凍干前從高密度培養(yǎng)基中獲得的菌泥與凍干保護(hù)劑混合后所得溶液。

1.3.4 復(fù)合凍干保護(hù)劑的篩選

從各類單體保護(hù)劑中選出凍干存活率較高的凍干保護(hù)劑，用正交試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)合，比較凍干后菌粉活菌數(shù)，篩選出最佳凍干保護(hù)劑組合。

1.3.5 菌泥與凍干保護(hù)劑質(zhì)量比優(yōu)化

設(shè)定菌泥與凍干保護(hù)劑質(zhì)量比分別為1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0，并在同一條件下進(jìn)行凍干，檢測(cè)凍干后菌粉活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

pH值、OD600nm、活菌數(shù)測(cè)定均設(shè)置3 組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基碳源、氮源及培養(yǎng)條件的確定

2.1.1 碳源、氮源的確定

碳源主要為微生物生長(zhǎng)提供細(xì)胞的碳架、細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量以及提供合成產(chǎn)物的碳架。一般的微生物培養(yǎng)中碳源主要采用糖類物質(zhì)。由表2可知，兩歧雙歧桿菌TMC3115對(duì)葡萄糖的利用度最高，其次為乳糖，因此，選擇葡萄糖作為兩歧雙歧桿菌TMC3115培養(yǎng)基的基礎(chǔ)碳源。

表2 不同碳源對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115生長(zhǎng)的影響Table2 Effects of different carbon sources on the growth of Bifidobacterim bifidum TMC3115

氮源是構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，也是微生物的大量營(yíng)養(yǎng)物。由圖1可知，胰酪蛋白胨、酵母蛋白胨、酵母浸粉FM902、酪蛋白胨對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115的培養(yǎng)效果較好。

圖1 不同氮源對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effects of different nitrogen sources on the growth of Bifidobacterim bifidum TMC3115

與本研究結(jié)果不同的是，熊三玉[21]研究發(fā)現(xiàn)，牛肉膏對(duì)雙歧桿菌培養(yǎng)液的OD600nm有較大正向影響。這可能與菌株自身特性有關(guān)。鑒于酪蛋白胨效果并不是最好而且價(jià)格偏高，選擇胰酪蛋白胨、酵母蛋白胨、酵母浸粉FM902進(jìn)行碳、氮源篩選正交試驗(yàn)。

表4 碳、氮源篩選4因素3水平正交試驗(yàn)結(jié)果Table4 Orthogonal array design in terms of coded values and experimental results for optimization of carbon and nitrogen sources

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，由表3～4可知，碳、氮源對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115生長(zhǎng)影響大小依次為B（胰酪蛋白胨）＞C（酵母蛋白胨）＞D（酵母浸粉FM902）＞A（葡萄糖）。根據(jù)K值比較得出理論最優(yōu)組合為A2B3C1D3，即葡萄糖添加量25 g/L、胰酪蛋白胨添加量20 g/L、酵母蛋白胨添加量10 g/L、酵母浸粉FM902添加量15 g/L。

表3 碳、氮源篩選4因素3水平正交試驗(yàn)因素水平Table3 Coded values and corresponding actual values of carbon and nitrogen source concentration used for orthogonal array designg/L

2.1.2 初始培養(yǎng)pH值確定

雙歧桿菌有其最適生長(zhǎng)pH值，培養(yǎng)基的初始pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其正常生長(zhǎng)。對(duì)于不同的雙歧桿菌，最適初始pH值有所不同。熊三玉[21]研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌生長(zhǎng)最佳pH值為6.5～8.5。而舒國(guó)偉等[22]研究表明，兩歧雙歧桿菌BB01及BB03的最佳發(fā)酵初始pH值分別為6.5和6.0。

由表5可知，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，兩歧雙歧桿菌TMC3115發(fā)酵液OD600nm先升高后降低，發(fā)酵液活菌數(shù)也是同樣的變化趨勢(shì)，最適初始pH值為7.2。

表5 不同培養(yǎng)基初始pH值對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115的影響Table5 Influence of initial medium pH on viable cell count of Bifidobacterim bifidum TMC3115

2.1.3 接種量確定

雙歧桿菌有其最適接種量，接種量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。國(guó)內(nèi)研究結(jié)果中不同菌株的最佳接種量差異不大，為3%～6%[21-23]。由表6可知，兩歧雙歧桿菌TMC3115接種量4%時(shí)所得的發(fā)酵液活菌數(shù)最高。

表6 不同接種量對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115生長(zhǎng)的影響Table6 Effects of different inoculum amounts on the growth of Bifidobacterim bifidum TMC3115

2.2 兩歧雙歧桿菌TMC3115發(fā)酵終止時(shí)間

圖3 兩歧雙歧桿菌TMC3115發(fā)酵液活菌數(shù)變化曲線Fig. 3 Variation in viable cell number during the culture of Bifidobacterim bifidum TMC3115

由圖2～3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液OD600nm、活菌數(shù)增大，pH值減小，發(fā)酵16 h時(shí)，菌落生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期，此時(shí)的活菌數(shù)最高，而pH值接近最低，說(shuō)明此時(shí)發(fā)酵液產(chǎn)酸最多，因此選擇16 h作為最終發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)。

圖2 兩歧雙歧桿菌TMC3115發(fā)酵液pH值、OD600 nm變化曲線Fig. 2 Variations in pH and OD600 nm during the culture of Bifidobacterim bifidum TMC3115

2.3 凍干工藝優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 凍干保護(hù)劑的篩選

菌體冷凍干燥后的存活率受多種因素影響，而保護(hù)介質(zhì)是其中重要的影響因素，良好的保護(hù)劑要求其在凍干過(guò)程中能為菌體提供保護(hù)作用，降低菌體死亡率。同時(shí)，有較好的自身穩(wěn)定性，容易與菌泥均勻混合，還可方便、有效除去凍干材料中的多余溶劑[24]。

由表7可知：對(duì)于兩歧雙歧桿菌TMC3115來(lái)說(shuō)，蛋白類凍干保護(hù)劑保護(hù)能力整體較高，如脫脂乳、乳清粉、酵母浸粉；多元醇類凍干保護(hù)劑中丙三醇效果最好；糖類凍干保護(hù)劑中海藻糖效果最好；氨基酸及氨基酸鹽類凍干保護(hù)劑中谷氨酸鈉效果最好，其次為脯氨酸；抗氧化劑類凍干保護(hù)劑中L-半胱氨酸鹽酸鹽效果最好。

表7 不同凍干保護(hù)劑對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115凍干存活率的影響Table7 Effects of different freeze-drying protectants on freeze-drying survival rate of Bifidobacterium bifidum TMC3115

2.3.2 復(fù)合凍干保護(hù)劑的篩選

由表8～9可知，對(duì)菌粉活菌數(shù)影響力大小依次為脫脂乳＞海藻糖＞丙三醇=谷氨酸鈉＞L-半胱氨酸鹽酸鹽，理論最佳組合為A4B4C1D4E1，最優(yōu)保護(hù)劑配方為脫脂乳添加量12%、海藻糖添加量12%、丙三醇添加量1.2%、谷氨酸鈉添加量0.6%、L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量0.15%。對(duì)于保護(hù)劑的篩選，不同研究中采用了不同的保護(hù)劑[24-25]。但是研究者均通過(guò)正交試驗(yàn)證明復(fù)合保護(hù)劑優(yōu)于某一種保護(hù)劑，可能是由于不同類型的保護(hù)劑通過(guò)不同保護(hù)機(jī)制的協(xié)同作用，達(dá)到了更好的保護(hù)效果。

表8 復(fù)合凍干保護(hù)劑5因素4水平正交試驗(yàn)因素水平Table8 Coded levels and corresponding actual levels of five freezedrying protectants in their blends used for orthogonal array design%

表9 復(fù)合凍干保護(hù)劑5因素4水平正交試驗(yàn)結(jié)果Table9 Orthogonal array design in terms of coded values with experimental results for optimization of freeze-drying protectant blends

2.3.3 菌泥與凍干保護(hù)劑質(zhì)量比優(yōu)化

由表10可知，隨著凍干保護(hù)劑添加量的增加，菌粉活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，菌泥與凍干保護(hù)劑質(zhì)量比1∶1.8時(shí)，菌粉活菌數(shù)達(dá)到最高，繼續(xù)增加凍干保護(hù)劑用量，菌粉活菌數(shù)反而降低。因此，菌泥與凍干保護(hù)劑最佳質(zhì)量比為1∶1.8。經(jīng)過(guò)各項(xiàng)條件優(yōu)化生產(chǎn)的兩歧雙歧桿菌TMC3115菌粉活菌數(shù)達(dá)到4.26×1011CFU/g。

表10 菌泥與凍干保護(hù)劑質(zhì)量比對(duì)菌粉活菌數(shù)的影響Table10 Effect of mass ratio between bacterial cells and freeze-drying protectant on the number of live cells after freeze-drying

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)兩歧雙歧桿菌TMC3115發(fā)酵培養(yǎng)基、pH值、接種量及發(fā)酵曲線的研究，得出培養(yǎng)基配方為葡萄糖添加量25 g/L、胰酪蛋白胨20 g/L、酵母蛋白胨10 g/L、酵母浸粉FM902 15 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、無(wú)水乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、吐溫-80 1 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5 g/L，pH值7.2，接種量4%，最佳發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為16 h。通過(guò)凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化和凍干保護(hù)劑與菌泥乳化比例研究，得出最優(yōu)凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳添加量12%、海藻糖12%、丙三醇1.2%、谷氨酸鈉0.6%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.15%，菌泥與凍干保護(hù)劑最佳質(zhì)量比為1∶1.8。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，最終制備的兩歧雙歧桿菌TMC3115菌粉活菌數(shù)達(dá)到4.26×1011CFU/g。本研究對(duì)于降低兩歧雙歧桿菌TMC3115的生產(chǎn)成本、提高其產(chǎn)能具有良好的指導(dǎo)作用。下一步將研究?jī)善珉p歧桿菌TMC3115的儲(chǔ)運(yùn)和保存環(huán)境，以提高其貨架期穩(wěn)定性，繼續(xù)為國(guó)產(chǎn)益生菌的生產(chǎn)與應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。