林帥東 續(xù)力云 陸暢暢 石邈 黃燕燕 樂(lè)涵波

分泌型絲氨酸蛋白酶型抑制劑Kazal 1（serine protease inhibitor kazal type 1,SPINK1）是一種大小為6.2 KDa的絲氨酸蛋白酶分泌抑制劑，最初分離于卵巢癌患者尿液，又名腫瘤相關(guān)組織抑制劑（tumor associated tissue inhibitor,TATI）[1]。此后，SPINK1 被發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)于多種腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等[2-3]。SPINK1的結(jié)構(gòu)與表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor,EGF）相似，可通過(guò)激活EGFR/MAPK信號(hào)通路刺激腫瘤細(xì)胞增殖從而影響腫瘤進(jìn)展，還可促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與腫瘤轉(zhuǎn)移[4-8]。

目前有多項(xiàng)研究對(duì)血清、腫瘤組織以及尿液進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了SPINK1作為生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值[3]。然而，SPINK1在肺腺癌患者血液中的表達(dá)情況如何尚不清楚。因此，筆者通過(guò)測(cè)定肺腺癌患者血清SPINK1濃度，分析其與癌組織SPINK1蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性以及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，探討其作為血清標(biāo)志物對(duì)浸潤(rùn)性肺腺癌的潛在診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2014年1月至2019年12月在浙江大學(xué)舟山醫(yī)院接受肺葉切除手術(shù)或肺楔形切除手術(shù)的153例肺腺癌患者的術(shù)前血液樣本及手術(shù)標(biāo)本，患者男55例，女98例，平均年齡56.2歲；其中原位腺癌38例，微浸潤(rùn)性腺癌39例，浸潤(rùn)性肺腺癌76例。選擇同期本院健康志愿者28例血液樣本，志愿者男10例，女18例，平均年齡55.7歲。兩組受試者性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均知情同意。

1.2 方法 兩組受試者均采集清晨空腹血2 ml。采血后立即離心，分離血清，保存于-80°C冰箱備用。

1.3 血清SPINK1濃度的檢測(cè) 采用ELISA法。按ELISA試劑盒（Human SPINK1 Duoset,R＆D system,USA）說(shuō)明書(shū)操作。將所有稀釋的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入孔中，室溫下孵育2 h，棄上清液，用洗滌緩沖液洗小孔3次，洗滌完畢后加入已稀釋的SPINK1抗體，室溫孵育2 h。再次用洗滌緩沖液洗3次，每孔加入100 μl稀釋的辣根過(guò)氧化物酶，室溫孵育20 min。用洗滌緩沖液洗3次后每孔中加入100 μl底物，室溫避光孵育20 min，加反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，上機(jī)檢測(cè)450 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算每個(gè)小孔中的SPINK1濃度。所有檢測(cè)的血清樣本以及標(biāo)準(zhǔn)樣本和空白對(duì)照均重復(fù)檢測(cè)3次。

1.4 肺腺癌患者癌組織及癌旁組織中SPINK1 mRNA的檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。將肺組織放入研磨器中，按照重量體積1∶9的比例加入1×PBS緩沖液，充分研磨后按4℃、3 000r/min、15 min離心，棄上清液，加入1 ml Trizol液并充分混勻后提取RNA。以提取的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物即cDNA，放于-20℃?zhèn)溆?。采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Applied Biosystems）進(jìn)行 qRT-PCR，并在 ABI 7500（Thermo，Waltham，MA） 按以下條件下運(yùn)行：95 ℃10 min，然后在95℃ 15 s變性，60℃ 1 min退火，72℃ 15延伸的40個(gè)循環(huán)中運(yùn)行。末次循環(huán)后行熔解曲線檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物單一性。SPINK1引物序列如下，上游引物：5'-ATATGACCCTGTCTGTGGGAC-3'，下游引物：5'-CAGCAAGGCCCAGATTTTTGA-3'，擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度為114 bp。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算SPINK1 mRNA的表達(dá)水平。

1.5 肺腺癌患者癌組織及癌旁組織SPINK1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色法。每個(gè)手術(shù)切除的組織樣本經(jīng)多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，連續(xù)切取4個(gè)4 μm厚切片。經(jīng)如下步驟：脫蠟、封閉、抗原修復(fù)，滴加小鼠抗人SPINK1單克隆抗體（Abcam）、沖洗、滴加生物素二抗、沖洗、顯色。在染色過(guò)程中，以磷酸鹽緩沖液代替原代抗體的切片作為陰性對(duì)照。由2位病理科副主任醫(yī)師評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)染色強(qiáng)度（stainingintensity,si）和陽(yáng)性細(xì)胞百分比（positivepercent,pp），并對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。si評(píng)分：0分為未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，1分為細(xì)胞陽(yáng)性染色最強(qiáng)處呈現(xiàn)弱陽(yáng)性，2分為陽(yáng)性，3分為可見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性染色的細(xì)胞。pp評(píng)分：0分為無(wú)染色陽(yáng)性區(qū)域，1分為陽(yáng)性染色區(qū)域≤10%，2分為陽(yáng)性染色區(qū)域11%～50%，3分為陽(yáng)性染色區(qū)域51%～80%，4分為陽(yáng)性染色區(qū)域＞80%。免疫組化染色得分=si分值×pp分值。最后按照得分分為高表達(dá)組（7～12分）與低表達(dá)組（0～6分）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。血清SPINK1濃度與癌組織SPINK1 mRNA表達(dá)水平的關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)；浸潤(rùn)性肺腺癌的預(yù)測(cè)因素分析采用單因素及多因素logistic回歸；通過(guò)繪制血清SPINK1以及癌胚抗原（CEA）的ROC曲線，評(píng)價(jià)血清SPINK1對(duì)浸潤(rùn)性肺腺癌的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌患者與健康志愿者血清SPINK1濃度的比較 浸潤(rùn)性肺腺癌患者血清SPINK1濃度為（1 868±105.5）pg/ml明顯高于健康志愿者的（842.0±70.36）pg/ml、原位腺癌的（966.2±75.18）pg/ml、微浸潤(rùn)性腺癌的（1 076±60.40）pg/ml，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）；而原位腺癌、微浸潤(rùn)性腺癌患者與健康志愿者間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 血清SPINK1濃度與肺腺癌組織SPINK1 mRNA水平的相關(guān)性分析 血清SPINK1濃度與癌組織SPINK1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.277，P=0.014），見(jiàn)圖1。以肺腺癌患者血清SPINK1濃度的平均值1 419 pg/ml為臨界值，分為血清SPINK1高濃度組71例和低濃度組82例，對(duì)比兩組患者癌組織SPINK1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清SPINK1低濃度組在SPINK1蛋白低表達(dá)組中上占29%，高濃度組在SPINK1蛋白低表達(dá)組中上占17%，血清SPINK1低濃度組在SPINK1蛋白高表達(dá)組中上占13%，高濃度組在SPINK1蛋白高表達(dá)組中上占41%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。典型患者肺腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織SPINK1蛋白表達(dá)見(jiàn)圖3。

圖1 血清分泌型絲氨酸蛋白酶型抑制劑Kazal 1（SPINK1）濃度與癌組織SPINK1 mRNA表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

圖2 血清分泌型絲氨酸蛋白酶型抑制劑Kazal 1（SPINK1）高濃度組與低濃度組患者癌組織SPINK1蛋白表達(dá)水平比較

圖3 典型患者免疫組織化學(xué)染色病理檢查圖（a：肺腺癌組織；b：相應(yīng)癌旁組織；×200）

2.3 肺腺癌患者血清SPINK1濃度與臨床病理特征的關(guān)系 高濃度組與低濃度組患者在性別、年齡、吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和胸膜侵犯間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而在病理類型、腫瘤大小以及 TNM分期間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 肺腺癌患者血清SPINK1濃度與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.4 浸潤(rùn)性肺腺癌預(yù)測(cè)因素分析 單因素分析發(fā)現(xiàn)，血清SPINK1濃度、CEA和腫瘤大小與浸潤(rùn)性肺腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。進(jìn)一步多因素分析顯示，血清SPINK1濃度、CEA和腫瘤大小是浸潤(rùn)性肺腺癌的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。見(jiàn)表3。

表3 浸潤(rùn)性肺腺癌預(yù)測(cè)因素分析

2.5 血清SPINK1濃度、CEA對(duì)浸潤(rùn)性肺腺癌的診斷價(jià)值 血清SPINK1濃度診斷的AUC為0.83，最佳截?cái)嘀禐? 288.5729 pg/ml，靈敏度為0.743，特異度為0.827。而CEA診斷的AUC為0.73，最佳截?cái)嘀禐?.975pg/ml，靈敏度為0.586，特異度為0.800。見(jiàn)圖4。

圖4 血清分泌型絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1（SPINK1）濃度和癌胚抗原（CEA）診斷浸潤(rùn)性肺腺癌的ROC曲線（a：血清SPINK1濃度；b：CEA）

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)SPINK1的氨基酸序列與表皮生長(zhǎng)因子（EGF）相似[9]。因此，SPINK1被認(rèn)為可能是一種自分泌或旁分泌生長(zhǎng)因子。有研究證實(shí)，SPINK1在多種惡性腫瘤血液中可被檢測(cè)到，但在肺腺癌血液中的研究還鮮有報(bào)道[10-11]。本研究前期發(fā)現(xiàn)，SPINK1在肺癌組織高表達(dá)并與預(yù)后相關(guān)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了肺腺癌血清SPINK1濃度及其在組織中表達(dá)水平的關(guān)系以及與臨床病理特征的關(guān)系，以及其作為浸潤(rùn)性肺腺癌診斷的潛在標(biāo)志物的可行性。

已有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)胰腺癌患者SPINK1血清濃度明顯升高[10]。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血漿SPINK1濃度亦顯著升高[11]。在50%的結(jié)直腸癌患者中亦觀察到血清SPINK1濃度升高并且與預(yù)后相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者相比，肺腺癌患者血清SPINK1表達(dá)上調(diào)，與目前的研究結(jié)果相一致。前期研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，肺腺癌組織SPINK1表達(dá)上調(diào)。在此基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步分析了血清SPINK1濃度與癌組織SPINK1表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清SPINK1濃度與癌組織SPINK1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，與癌組織SPINK1蛋白表達(dá)水平亦呈正相關(guān)，提示血清SPINK1濃度隨著癌組織SPINK1表達(dá)水平變化而變化，提示血清濃度可反映癌組織SPINK1表達(dá)水平，具有作為血清診斷標(biāo)志物的潛力。

本研究進(jìn)一步分析了肺腺癌患者血清SPINK1濃度與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度組與低濃度組患者在不同病理類型、腫瘤大小以及TNM分期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，與原位腺癌與微浸性肺腺癌組相比，浸潤(rùn)性肺腺癌相血清SPINK1高濃度者占比較高。2011年公布的肺腺癌新分類標(biāo)準(zhǔn)中指出，原位腺癌與微浸性肺腺癌，這兩類患者若接受根治性手術(shù)，則其疾病特異性生存率分別為100%或接近100%，而浸潤(rùn)性肺腺癌生存率相對(duì)較低。因此，原位腺癌與微浸潤(rùn)腺癌被認(rèn)為是早期腺癌階段，而浸潤(rùn)性肺腺癌惡性程度較高。筆者發(fā)現(xiàn)，與腫瘤大小≤1 cm組相比，＞1 cm組肺腺癌血清SPINK1高濃度者占比較高；與TisN0M0～Ⅰ組相比，Ⅱ～Ⅳ分期組血清SPINK1高表達(dá)者占比亦較高。以上結(jié)果提示，血清SPINK1可能是惡性程度較高肺腺癌診斷的標(biāo)志物。筆者進(jìn)一步探討了SPINK1對(duì)浸潤(rùn)性肺腺癌的診斷效能，結(jié)果顯示，AUC可達(dá)0.83，靈敏度為0.743，特異度為0.827，表明血清SPINK1對(duì)浸潤(rùn)性肺腺癌具有良好的診斷效能。因此，本研究認(rèn)為血清SPINK1可作為浸潤(rùn)性肺腺癌的血清生物標(biāo)志物。然而，血清SPINK1的確切來(lái)源，具體是由哪些類型的細(xì)胞分泌而來(lái)的尚無(wú)直接證據(jù)?，F(xiàn)有研究報(bào)道以及本研究結(jié)果提示，血清SPINK1可能是部分腫瘤細(xì)胞分泌而來(lái)。然而，發(fā)表于Nature Communication的一項(xiàng)研究證實(shí)，腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞能夠分泌SPINK1[13]。因此，筆者推測(cè)部分血清SPINK1是由腫瘤基質(zhì)細(xì)胞分泌的。分泌的SPINK1在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本研究尚有不足之處。首先，納入的肺腺癌患者尚無(wú)5年生存數(shù)據(jù)，因此，不能分析血清SPINK1與患者預(yù)后關(guān)系。其次，樣本例數(shù)相對(duì)較少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。本研究探索的SPINK1作為浸潤(rùn)性肺腺癌患者血清診斷標(biāo)志物的可行性，將為肺腺癌的診斷提供新的靶點(diǎn)。