鄭月華 韓雪 湯磊磊

腦卒中是全球成年人致殘、致死的主要原因之一，世界范圍內(nèi)成年人群腦卒中的發(fā)病率為25%，而我國則高達(dá)39%[1]。缺血性腦卒中是腦卒中中最主要的類型，占69.6%～77.8%[2]，目前臨床上最為有效的治療方式是藥物溶栓治療，如重組組織型纖溶酶原激活物（rt-PA）。但rt-PA治療時間窗狹窄，可使腦內(nèi)出血轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)增加，限制了其臨床應(yīng)用[3]。而腦缺血再灌注（cerebral ischemic/reperfusion,I/R）過程會對腦組織造成二次損傷，導(dǎo)致腦水腫或出血，甚至破壞血腦屏障，因此神經(jīng)保護(hù)劑被認(rèn)為是治療缺血性卒中更有潛力的藥物。

欖香烯是從我國傳統(tǒng)中藥姜科植物莪術(shù)中提取出來的一種中藥單體，已在臨床應(yīng)用于廣譜惡性腫瘤的治療[4]。研究表明欖香烯可降低腦缺血小鼠腦組織炎癥因子水平，在小鼠全腦缺血模型中亦可通過抗凋亡機(jī)制改善急性期神經(jīng)損傷[5-6]。欖香烯雖然在腦血管病的治療中取得較好療效，然而其在腦缺血慢性期的作用及相關(guān)機(jī)制并不明確。研究證實(shí)氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和自噬等病理事件參與了腦I/R損傷的病理生理過程，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[7]。因此，尋找針對多種機(jī)制進(jìn)行干預(yù)的神經(jīng)保護(hù)劑是治療腦缺血的有效策略。本研究以腦缺血大鼠為研究對象，探討欖香烯對腦I/R慢性損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 欖香烯乳注射液（規(guī)格：0.1 g∶20 ml；批號：20190402）購自大連金港制藥有限公司；4%多聚甲醛（批號：190203）購自上海酶聯(lián)生物公司；HE試劑盒購自美國Richard-Allan Scientific公司；TTC染色液（批號：BCCC3620）購自美國Sigma公司；原位末端標(biāo)記法（TUNEL）試劑盒（批號：31124）購自美國 Roche公司；苯甲?；酋７≒MSF）和RIPA組織裂解液均購自上海康成生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、脫脂奶粉、5×蛋白上樣緩沖液和ECL超敏化學(xué)發(fā)光液均購自武漢谷歌生物科技有限公司；B細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG二抗和辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgG二抗均購自中國武漢proteintech生物技術(shù)有限公司；微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）抗體購自美國Sigma公司；p62抗體購自美國Abcam公司。Leica切片儀（型號：EMUC7）和倒置相差顯微鏡（型號：DMI3000B）均購自德國Leica公司；化學(xué)成像分析儀（型號G:BOX）購自英國Syngene公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物、建模及分組 48只清潔級SD雄性大鼠，體重（220±20）g，購自杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)條件：溫度（22±3）℃，相對濕度 45%～65%，通風(fēng)換氣10～15次/h，晝/夜各12 h光照周期循環(huán)。動物可自由飲食、飲水。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SYXK（浙）2019-0011。采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為欖香烯低劑量組（1 mg/kg）、欖香烯高劑量組（10 mg/kg）、模型組和假手術(shù)組，每組12只。大鼠大腦中動脈阻斷（middle cerebral artery blockage，MCAO）模型建立參照文獻(xiàn)[8]。欖香烯低劑量組、欖香烯高劑量組和模型組大鼠用10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定于泡沫板上，剃去頸部毛發(fā)，75%乙醇溶液消毒，沿頸正中線切口，分離肌肉和筋膜，分離暴露頸總、頸外和頸內(nèi)動脈。用動脈夾暫時夾閉頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈，在頸總動脈分叉下方4 mm處剪一小口，將線栓（長4 cm，直徑0.25 mm）從開口處插入，插入頸內(nèi)動脈17～18 mm且遇到有輕微阻力感為止，結(jié)扎頸內(nèi)和頸總動脈遠(yuǎn)心端以固定線栓，縫合皮膚。缺血90 min后，拔出線栓再灌注14 d。假手術(shù)組大鼠僅暴露頸內(nèi)外動脈分支，不閉塞大腦中動脈。術(shù)后大鼠置于電熱毯上維持體溫36.5～37.5℃。欖香烯溶于0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液，腹腔注射，手術(shù)當(dāng)天起連續(xù)給藥14 d，1次/d，首次給藥時間為術(shù)前30 min；模型組和假手術(shù)組大鼠腹腔注射0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液。

1.3 方法

1.3.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分測定 采用Longa等[8]報(bào)道的評分標(biāo)準(zhǔn)，各組隨機(jī)取6只大鼠在給藥14 d后進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：未見明顯異常為0分；將大鼠尾巴提起后其對側(cè)前爪不能完全伸展為1分；大鼠向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分；大鼠損傷側(cè)癱瘓或傾倒，出現(xiàn)重度神經(jīng)功能損傷為3分；大鼠無自發(fā)性走，意識喪失為4分。

1.3.2 大鼠腦梗死體積檢測 上述每組6只大鼠行TTC染色。大鼠麻醉后，進(jìn)行0.9%氯化鈉溶液心臟灌流，待血液完全流盡后斷頭取腦，剔除嗅球、小腦和低位腦干，-20℃冷凍20 min后沿冠狀面切成厚度約2 mm的5張切片，并置于2%TTC染色液中充分浸泡，37℃避光孵育30 min，再置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，取出切片進(jìn)行拍照。染色呈紅色為正常腦組織，白色為梗死組織。采用Image J圖像分析軟件測量腦梗死體積。腦梗死面積（%）=（5片大腦非缺血側(cè)梗死面積－5片大腦缺血側(cè)未梗死面積）/5片大腦腦總面積×100%。腦梗死面積乘以厚度（2 mm）后即為腦梗死體積[9]。

1.3.3 大鼠腦組織皮層神經(jīng)元形態(tài)觀察 每組再隨機(jī)抽取3只大鼠，處死方法同上，取出腦組織后置于4%多聚甲醛室溫固定24 h，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。4 μm厚度切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察皮層組織并拍照。

1.3.4 大鼠腦組織皮層神經(jīng)元凋亡數(shù)檢測 采用TUNEL染色。將上述各組3只大鼠腦組織石蠟切片用抗神經(jīng)元核抗體4℃孵育過夜，PBS清洗3遍，TUNEL試劑37℃孵育1 h，在顯微鏡下觀察并拍照，用Image J圖像分析軟件計(jì)算皮層神經(jīng)元凋亡數(shù)。

1.3.5 Bcl-2、Caspase-3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62 表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。每組剩余的3只大鼠同上述方法處死后取出腦組織，用鑷子小心分離出大腦皮層組織，立即凍存于-80℃冰箱。檢測時取出樣本置于冰上融化，稱取100 mg皮層組織放入含PMSF的500 μl裂解液中，加入鋼珠，在研磨器上震蕩研磨，90 Hz，60 s，裂解后的組織12 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清液。每組上樣30 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠（SDSPAGE）電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉 1 h，分別加入 Bcl-2（1∶1 000）、Caspase-3（1∶800）、LC3B（1∶800）、p62（1∶800）和 GAPDH（1∶1 000）一抗在4℃搖床孵育過夜，三乙醇胺+Tween緩沖鹽溶液（TBST）清洗3次，每次5 min。加入二抗（1∶3 000）室溫孵育1.5 h，使用TBST清洗3次，每次5 min。在暗室中使用ECL顯色后用化學(xué)成像分析儀獲取蛋白條帶，GAPDH作為內(nèi)參，使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，欖香烯低劑量和高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（分）

2.2 4組大鼠腦梗死體積比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死體積明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，欖香烯低劑量和高劑量組大鼠腦梗死體積均明顯縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2和圖1（插頁）。

表2 4組大鼠腦梗死體積比較（%）

圖1 4組大鼠腦梗死體積TTC染色圖（a：假手術(shù)組；b：模型組；c：欖香烯低劑量組；d：欖香烯高劑量組）

2.3 4組大鼠腦組織皮層神經(jīng)元形態(tài)比較 HE染色結(jié)果顯示，除假手術(shù)組外，模型組、欖香烯低劑量組和欖香烯高劑量組大鼠腦組織皮層神經(jīng)元均出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、不規(guī)則，碎片化。與模型組相比，欖香烯低劑量組和欖香烯高劑量組大鼠腦組織皮層神經(jīng)元細(xì)胞核畸形有所改善。見圖2（插頁）。

圖2 4組大鼠皮層神經(jīng)元形態(tài)HE染色圖（a：假手術(shù)組；b：模型組；c：欖香烯低劑量組；d：欖香烯高劑量組；黑色箭頭指示畸形神經(jīng)元，標(biāo)尺：100 μm；×200）

2.4 4組大鼠腦組織皮層神經(jīng)元凋亡數(shù)比較 TUNEL染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠皮層神經(jīng)元核固縮明顯，呈碎片狀、深棕色顆粒，神經(jīng)元凋亡數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，欖香烯低劑量組和欖香烯高劑量組大鼠腦組織皮層神經(jīng)元凋亡數(shù)均呈不同程度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表3和圖3（插頁）。

圖3 4組大鼠皮層神經(jīng)元TUNEL染色圖（a：假手術(shù)組；b：模型組；c：欖香烯低劑量組；d：欖香烯高劑量組；黑色箭頭指示凋亡的神經(jīng)元，標(biāo)尺：100 μm；×200）

表3 4組大鼠皮層神經(jīng)元凋亡數(shù)比較（個）

2.5 4 組大鼠腦組織 Bcl-2、Caspase-3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2、p62表達(dá)水平均明顯下調(diào)，Caspase-3表達(dá)水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組相比，欖香烯高劑量組Bcl-2表達(dá)水平明顯上調(diào)，欖香烯高劑量和低劑量組Caspase-3表達(dá)水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯下調(diào)，p62表達(dá)水平均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見圖4、5和表4。

表4 4組大鼠凋亡和自噬蛋白表達(dá)水平比較

圖4 4組大鼠皮層凋亡蛋白表達(dá)的電泳圖（a：假手術(shù)組；b：模型組；c：欖香烯低劑量組；d：欖香烯高劑量組；Caspase-3為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Bcl-2為B細(xì)胞瘤-2）

圖5 4組大鼠皮層自噬蛋白表達(dá)的電泳圖（a：假手術(shù)組；b：模型組；c：欖香烯低劑量組；d：欖香烯高劑量組；LC3為微管相關(guān)蛋白輕鏈3）

3 討論

腦卒中是指腦內(nèi)動脈狹窄、閉塞或破裂造成腦血液循環(huán)障礙的一種神經(jīng)性疾病，目前研究主要集中于缺血性腦卒中。針對缺血性腦卒中的治療策略，首選溶栓治療。然而，臨床缺血性腦卒中的溶栓率和rt-PA的使用率均很低[10]，目前尚缺乏有效治療腦缺血的神經(jīng)保護(hù)藥物。因此，深入探索缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制，尋找治療腦缺血的有效措施具有積極的意義。

莪術(shù)作為姜科植物的根莖，具有行氣破血、消積止痛的功效，欖香烯是其揮發(fā)油中提取的單體[11]，它是我國自行開發(fā)研制的國家級二類廣譜抗腫瘤新藥，在臨床上常用作抗腫瘤輔助藥物。欖香烯靜脈或口服給藥后，均有部分藥物可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織[12]。研究表明，欖香烯通過抗炎和抗凋亡機(jī)制可改善全腦缺血急性損傷[6]，欖香烯還可通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞RAC1蛋白/蛋白激酶3/p38信號通路改善敗血癥誘導(dǎo)的小鼠腦損傷，提高學(xué)習(xí)記憶能力[13]。另有研究也發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg欖香烯能顯著改善外傷性腦損傷鼠神經(jīng)功能評分[14]。本研究采用MCAO模型大鼠缺血1.5 h再灌注14 d，結(jié)果顯示經(jīng)欖香烯處理能顯著提高腦I/R 14 d后神經(jīng)功能評分，減少腦梗死體積；而從形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，欖香烯可改善大腦皮層神經(jīng)元損傷情況。本研究結(jié)果提示，欖香烯對MCAO模型大鼠慢性損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。

腦缺血再灌注引發(fā)了一系列缺血級聯(lián)反應(yīng)，最終觸發(fā)神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)功能損傷。研究表明興奮性毒性、凋亡、自噬和炎癥作為腦I/R的關(guān)鍵分子事件，在正向反饋中觸發(fā)彼此，參與腦缺血損傷病理過程[15]，靶向這些機(jī)制顯示出良好的神經(jīng)保護(hù)作用。腦缺血后數(shù)小時稱為急性期，主要病理過程為神經(jīng)元損傷和炎癥反應(yīng)；腦缺血慢性期出現(xiàn)在缺血后數(shù)天至數(shù)月，本研究采用大鼠I/R 14 d作為腦缺血慢性期模型，持久的缺血觸發(fā)神經(jīng)元自噬上調(diào)，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡[16-17]。在小鼠持續(xù)性MCAO模型中缺血誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬，造成腦損傷，自噬抑制劑3-MA可顯著減少腦梗死、腦水腫和神經(jīng)功能缺陷，提示過度自噬參與了腦缺血損傷過程[18]。研究發(fā)現(xiàn)欖香烯可通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蘇氨酸激酶/雷帕霉素靶蛋白信號通路誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549發(fā)生保護(hù)性自噬[19]，表明欖香烯參與自噬活性的調(diào)節(jié)，然而其在腦缺血慢性損傷中對自噬的影響還不明確。泛素結(jié)合蛋白p62在靶向錯誤折疊的蛋白通過自噬溶酶體途徑降解，在抑制線粒體凋亡和氧化應(yīng)激方向發(fā)揮重要作用。p62與LC3相結(jié)合形成復(fù)合物，通過氮端的PB1結(jié)構(gòu)域與LC3-Ⅱ結(jié)合，參與自噬小體的形成，并在自噬溶酶體中降解，引發(fā)自噬，因此兩者可以看作自噬體的標(biāo)記蛋白[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯能夠顯著抑制腦I/R 14 d后大鼠皮層LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，提高p62表達(dá)水平，提示欖香烯發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用與抑制過度自噬有關(guān)。

大量證據(jù)表明氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是缺血性腦卒中病理生理學(xué)中常見的現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞特征性改變包括細(xì)胞皺縮、核破裂和DNA片段化等。Bcl-2及其家族成員是最強(qiáng)大的死亡抑制蛋白之一，并且抑制Caspase-依賴性和Caspase-非依賴性細(xì)胞死亡[21]。有研究顯示抑制Caspase-3激活可減少鼠MCAO模型腦梗死體積[22]。欖香烯能夠降低大鼠腦外傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減少TUNEL陽性細(xì)胞和Caspase-3表達(dá)[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)欖香烯可上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平，下調(diào)Caspase-3水平，從而顯著減少腦I/R損傷后皮層神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。以上結(jié)果提示欖香烯的神經(jīng)保護(hù)作用是通過抑制過度自噬和凋亡實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，欖香烯處理可能通過抑制大鼠腦I/R 14 d后皮層過度自噬和凋亡，而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究為腦缺血的治療提供新的研究思路，但欖香烯調(diào)控自噬和凋亡的具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。