魯光輝 李新峰 馮亮 羅玲 王海華

癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前我國約有900萬癲癇患者，是僅次于腦血管疾病的第二大腦部疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)30%～40%的癲癇患者存在不同程度認(rèn)知功能障礙，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力降低，其中以視覺空間記憶能力、短時(shí)記憶能力損傷最為嚴(yán)重，嚴(yán)重影響癲癇患者的生活質(zhì)量[2]。海馬是參與空間學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，癲癇發(fā)病過程中大腦神經(jīng)元過度興奮和異常同步放電導(dǎo)致活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）、炎癥細(xì)胞因子大量生成，引發(fā)海馬神經(jīng)元損傷是癲癇所致認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制[3-5]。銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B,GB）是從銀杏葉中提取的一種倍半萜內(nèi)酯化合物，具有良好的抗氧化和抗炎活性[6-7]；但GB能否通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)改善癲癇所致認(rèn)知功能障礙的報(bào)道少見。筆者通過研究GB對(duì)癲癇模型大鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的影響，探討GB對(duì)癲癇模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬神經(jīng)元病變的影響及其機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 試劑：GB粉末（美國Sigma公司，批號(hào)：BN90418）；丙戊酸鈉粉針劑（sodium valproate，VPA，成都諾迪康生物制藥有限公司，規(guī)格：0.4 g/瓶，批號(hào)：20190716）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：190704、190811、190724）；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）。儀器：WMT-100 型Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)（四川成都儀器廠）；Synergy-HT型多功能酶標(biāo)儀（美國 BioTck公司）；RM2125型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；TDK-BMB型石蠟包埋機(jī)（孝感泰康達(dá)醫(yī)療設(shè)備公司）；SZ-1型組織勻漿器（江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠180只，體重220～250 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 [許可證號(hào)：SCXK（冀）2018-004]，適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、GB低、中、高劑量組（2.5、5、10 mg/kg）[8]和 VPA（300 mg/kg）組[9]，每組 30 只。

1.3 造模與給藥方法 除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠均參照陳姝璇等[10]報(bào)道的氯化鋰-匹羅卡品法誘導(dǎo)制備癲癇大鼠模型：腹腔注射氯化鋰溶液127 mg/kg，20 h后背部皮下注射匹羅卡品溶液15 mg/kg。藥物配制：精確稱量GB粉末200 mg，加入10 ml二甲基亞砜溶解后，加入適量0.9%氯化鈉注射液制備濃度2 mg/ml的GB溶液，然后依次用0.9%氯化鈉注射液稀釋制備濃度1 mg/ml、0.5 mg/ml的GB溶液；取VPA粉針劑加入適量0.9%氯化鈉注射液制備濃度60 mg/ml的VPA溶液。給藥方法：GB低、中、高劑量組分別在注射匹羅卡品前30 min腹腔注射濃度為0.5、1、2 mg/ml的GB溶液（注射量為5 ml/kg）；VPA組在注射匹羅卡品前30 min腹腔注射濃度為60mg/ml的VPA溶液（注射量為5 ml/kg）；模型組和空白對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（注射量為 5 ml/kg）。

1.4 大鼠行為學(xué)觀察 注射匹羅卡品后2 h內(nèi)觀察各組大鼠行為學(xué)變化，記錄癲癇發(fā)作潛伏期和癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間，參照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠癲癇發(fā)作程度進(jìn)行分級(jí)[11]：無發(fā)作為0級(jí)；須動(dòng)及口周、面部肌肉抽搐為Ⅰ級(jí)；點(diǎn)頭或濕狗樣頻繁抖動(dòng)為Ⅱ級(jí)；前肢局限性陣攣為Ⅲ級(jí)；前肢局限性陣攣伴后肢站立的全身強(qiáng)直性發(fā)作為Ⅳ級(jí)；伴有站立并摔倒、翻滾的全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作為Ⅴ級(jí)。

1.5 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測定 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮平臺(tái)固定于第Ⅲ象限，水溫設(shè)置為（25±1）℃，注射匹羅卡品24 h后，各組按照隨機(jī)數(shù)字表法取10只大鼠，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，每天訓(xùn)練4次，分別于第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限面朝池壁輕輕放入水中，訓(xùn)練過程中誘導(dǎo)大鼠找到第Ⅲ象限平臺(tái)。

1.5.1 大鼠學(xué)習(xí)能力測定 采用定位航行實(shí)驗(yàn)。將每只大鼠分別在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限面朝器壁方向放入水中，記錄每只大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，120 s內(nèi)未能找到平臺(tái)則按120 s計(jì)算，各組大鼠取平均值，即逃避潛伏期。

1.5.2 大鼠記憶能力測定 采用空間探索實(shí)驗(yàn)。撤除第Ⅲ象限平臺(tái)，每只大鼠于第Ⅰ象限面朝器壁方向放入水中，記錄120 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.6 大腦海馬神經(jīng)元病理學(xué)檢查 注射匹羅卡品24 h后，在各組剩余的20只大鼠中按隨機(jī)數(shù)字表法再取10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液3 ml/kg進(jìn)行麻醉后開胸、暴露心臟，由左心室-右心耳通路依次灌注0.9%氯化鈉溶液300 ml、4%多聚甲醛溶液300 ml，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液固定72 h后，行石蠟包埋、4 μm厚度切片、透明和脫蠟后行常規(guī)HE染色，中性樹脂封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察大腦海馬神經(jīng)元病理學(xué)改變。

1.7 大腦海馬組織生化指標(biāo)檢測 注射匹羅卡品24 h后，取各組剩余的10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液3 ml/kg進(jìn)行麻醉后予頸椎脫臼處死，斷頭取腦并剝離海馬，加入9倍量冷裂解液后研磨勻漿，4℃離心（r=10 cm、3 000 r/min、10 min）取上清液，然后采用黃嘌呤氧化法和鉬酸銨法分別檢測SOD、CAT活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA水平；并采用ELISA法檢測海馬組織 TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane's T2法；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)的比較 空白對(duì)照組大鼠行為正常，未出現(xiàn)癲癇發(fā)作，癲癇發(fā)作程度為0級(jí)。與模型組比較，GB中、高劑量組和VPA組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長、發(fā)作持續(xù)時(shí)間縮短、發(fā)作程度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與VPA組比較，GB高劑量組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長、發(fā)作持續(xù)時(shí)間縮短、發(fā)作程度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長、穿越平臺(tái)次數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，GB中、高劑量組和VPA組逃避潛伏期縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；與VPA組比較，GB高劑量組逃避潛伏期縮短且穿越平臺(tái)次數(shù)增多（P＜0.05或 0.01）。見圖 1（插頁）、表 2。

圖1 各組大鼠典型定位巡航實(shí)驗(yàn)軌跡圖[a：空白對(duì)照組；b：模型組；c：銀杏內(nèi)酯 B（GB）低劑量組；d：GB 中劑量組；e：GB 高劑量組；f：丙戊酸鈉（VPA）組]

表2 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)的比較

2.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)改變比較 空白對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，排列整齊、層次清晰，核膜、核仁清晰；模型組海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則，數(shù)量減少、間隙增大，排列紊亂、層次不清，胞體固縮、深染等病理學(xué)改變；與模型組比較，GB各劑量組和VPA組大鼠海馬神經(jīng)元上述病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變呈不同程度減輕；其中GB高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)量減少不明顯、形態(tài)較規(guī)則、排列較整齊，效果優(yōu)于其它組。見圖2（插頁）。

圖2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)改變比較[a：空白對(duì)照組；b：模型組；c：銀杏內(nèi)酯 B（GB）低劑量組；d：GB 中劑量組；e：GB 高劑量組；f：丙戊酸鈉（VPA）組；HE 染色，×400]

2.4 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織SOD、CAT活性降低，MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，GB中、高劑量組和VPA組SOD、CAT活性升高，MDA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或 0.01）；與VPA組比較，GB高劑量組SOD活性升高且MDA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA水平比較

2.5 各組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，GB中、高劑量組和VPA組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與VPA組比較，GB高劑量組TNF-α、IL-6水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（pg/ml）

3 討論

癲癇是一種由于大腦神經(jīng)元高度同步異常放電而引發(fā)的腦功能障礙綜合征，具有自發(fā)性、反復(fù)性發(fā)作的特點(diǎn)，我國癲癇發(fā)病率高達(dá)千分之七，是僅次于腦卒中的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病。認(rèn)知功能受損是癲癇患者最常見的并發(fā)癥，與患病時(shí)程呈正相關(guān)，是影響患者生活質(zhì)量的重要因素，抑制癲癇后認(rèn)知功能障礙是當(dāng)前腦科學(xué)研究熱點(diǎn)之一。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)所致海馬神經(jīng)元損傷與認(rèn)知功能障礙的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。因此，尋找靶向抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的新型藥物減輕海馬神經(jīng)元損傷，或許是改善癲癇患者預(yù)后的有效途徑。

GB是從中藥銀杏葉中提取的一種小分子活性單體化合物，具有抗氧化、抗凋亡等藥理學(xué)作用，較易通過血腦屏障；Li等[6]和劉暉等[12]研究發(fā)現(xiàn)GB能夠通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)減輕大鼠缺血性腦損傷。VPA是一種廣泛應(yīng)用于臨床的廣譜抗癲癇藥，也是新型抗癲癇藥研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的常用陽性對(duì)照藥物。臨床上以顳葉癲癇最為常見，癲癇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備方法主要有電點(diǎn)燃和化學(xué)點(diǎn)燃兩大類，其中氯化鋰-匹羅卡品化學(xué)點(diǎn)燃法制備的癲癇大鼠模型為顳葉癲癇，與人類癲癇病理特點(diǎn)一致，并且操作簡便、重復(fù)性高，是公認(rèn)的癲癇大鼠模型制作方法[13]。本研究采用氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)制備癲癇大鼠模型，以VPA作為陽性對(duì)照藥物，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)GB干預(yù)能夠明顯延長大鼠癲癇發(fā)作潛伏期、縮短持續(xù)時(shí)間、降低發(fā)作程度，明顯改善癲癇大鼠海馬神經(jīng)元病變，并且GB高劑量組效果優(yōu)于VPA組，提示GB具有保護(hù)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元并抑制癲癇發(fā)作的作用。

Morris水迷宮是目前世界公認(rèn)的學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)價(jià)方法，主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)[14]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)GB干預(yù)能夠明顯改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并且GB高劑量組效果優(yōu)于VPA組，提示GB具有改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。

ROS代謝失衡是導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的基礎(chǔ)。癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)元過度興奮和異常放電導(dǎo)致ROS大量生成與釋放[15]，以ROS為底物的抗氧化酶（SOD、CAT）被過度消耗致使ROS過剩，ROS攻擊破壞核酸、蛋白質(zhì)及生物膜脂質(zhì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，生成具有生物毒性的MDA，因此SOD、CAT活性和MDA水平能夠反映機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GB干預(yù)能夠明顯提高癲癇大鼠海馬組織SOD、CAT活性并降低MDA水平，并且GB高劑量組對(duì)SOD活性和MDA水平的調(diào)控作用優(yōu)于VPA組，提示GB對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷具有抑制作用。

癲癇發(fā)病過程大腦神經(jīng)元過度興奮與異常同步放電刺激炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）大量釋放，引發(fā)系列炎癥反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷。并且TNF-α、IL-1β作為炎性趨化因子能夠刺激粒細(xì)胞而進(jìn)一步釋放炎癥因子，形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)而加重炎癥損傷[17]；IL-6則能夠刺激細(xì)胞大量產(chǎn)生ROS而加重氧化應(yīng)激損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GB干預(yù)能夠明顯降低癲癇大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平，并且GB高劑量組對(duì) TNF-α、IL-1β、IL-6 的調(diào)控作用優(yōu)于VPA組，提示GB對(duì)癲癇大鼠海馬組織在這炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

綜上所述，GB能夠延長癲癇模型大鼠癲癇發(fā)作潛伏期、縮短發(fā)作持續(xù)時(shí)間、降低發(fā)作強(qiáng)度，改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與GB通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而保護(hù)海馬神經(jīng)元有關(guān)。