陳姿如，杜書明

百草枯(paraquat, PQ)，是一種快速滅生性除草劑，可經(jīng)由皮膚、黏膜、呼吸道、消化道等進(jìn)入人體，以肺部分布最多，損傷最大，肺纖維化伴呼吸衰竭是患者中毒后期死亡的主要原因，且因其在臨床上沒有特效解毒的手段，病死率高達(dá)80%以上[1，2]。我國2016年7月禁止生產(chǎn)和使用百草枯，但臨床上百草枯中毒案例依舊存在。中毒患者體內(nèi)百草枯濃度與病死率有著密切的關(guān)系，測(cè)定患者血漿中百草枯濃度不僅有助于準(zhǔn)確診斷，并對(duì)制定合理的治療方案有重要意義。本實(shí)驗(yàn)旨在探討使用合適的樣品前處理方法，建立靈敏、快速檢測(cè)百草枯中毒的紫外分光光度法，為基層醫(yī)院快速診斷百草枯中毒提供幫助。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 采用UV-2600紫外/可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；7820氣相色譜儀(山東魯南瑞紅化工儀器有限公司)，氮磷檢測(cè)器(NPD)，DB-5毛細(xì)色譜柱(30 m×0.23 mm×0.25 μm)，LC-LX-H165A高速離心機(jī)。試劑：保險(xiǎn)粉(連二亞硫酸鈉)，碳酸氫鈉，飽和氫氧化鈉溶液(現(xiàn)配)，20%高氯酸甲醇溶液，20%硼氫化鈉溶液，環(huán)己烷化學(xué)試劑均為分析純，百草枯對(duì)照品購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法 抽取患者靜脈血3 ml(同時(shí)做健康人對(duì)照)，3000 r/min高速離心后，取0.5 ml血漿于帶蓋的5 ml塑料試管中，加新鮮配制的20%高氯酸甲醇溶液0.2 ml 充分振蕩30 s混勻，以 12 000 r/min高速離心10 min。取上清液0.5 ml，加入碳酸氫鈉0.2 mg堿化和連二亞硫酸鈉0.5 mg顯色，再加飽和氫氧化鈉溶液0.1 ml增色，pH>14，采用50 μl微量比色池，設(shè)置200～700 nm波長自動(dòng)掃描，以蒸餾水做基線測(cè)量，掃描待測(cè)液，百草枯吸收峰出現(xiàn)在紫外區(qū)(395±2)nm和可見光區(qū)(605±2)nm，空白液掃描不顯色，無吸收峰，記錄最大吸收峰(605±2)nm吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求出血漿中百草枯含量。另取0.5 ml血漿加入20%高氯酸甲醇溶液高速離心取上清液加強(qiáng)和氫氧化鈉液0.1 ml，再加入20%硼氫化鈉溶液0.5 ml，于室溫反應(yīng)30 min，加入環(huán)己烷0.5 ml,振蕩30 s，高速離心，取上清液作為檢材樣品衍生液，供氣相色譜分析或氣相色譜質(zhì)譜法分析。

1.3 監(jiān)測(cè)指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn) 檢驗(yàn)血液中的百草枯，按我國公安部發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)(GA/T1629-2019)執(zhí)行。檢測(cè)、工作曲線、檢出限及回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)百草枯紫外測(cè)定方法的特異性和穩(wěn)定性進(jìn)行分析。

1.4 檢測(cè)波長的選擇 配制0、5.0、10.0、15、20.0 μg/ml的百草枯水溶液，以蒸餾水做空白，取5個(gè)帶蓋的5.0ml塑料試管加不同濃度百草枯水溶液0.5 ml，空白管加蒸餾水0.5 ml，然后按照1.2血樣處理及試驗(yàn)方法操作，百草枯最大吸收峰為(605±1)nm，以最大吸收峰定性定量。同時(shí)配置0.0、5.0、10.0、20.0μg/ml的百草枯血漿標(biāo)本，按照1.2血樣處理及試驗(yàn)方法操作，結(jié)果百草枯掃描可見光最大吸收光譜在(605±1)nm，血漿中的百草枯同樣在(605±2)nm處有最大吸收峰。

1.5 工作曲線和檢出限 精確稱取百草枯對(duì)照品100 mg置于100 ml定量瓶中，加蒸餾水配成1 mg/ml的百草枯標(biāo)準(zhǔn)貯存液，貯存液采用健康人血漿配制為0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0、20.0、40 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.2血樣處理及試驗(yàn)方法操作。根據(jù)吸光度值(y)和對(duì)應(yīng)的濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，百草枯濃度在0.05～40.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程(y)=0.0896+0.0102，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9992，檢測(cè)下限為0.05 μg/ml。

1.6 回收率和精密度試驗(yàn) 采用空白血樣加標(biāo)的方式進(jìn)行回收試驗(yàn)，分別添加0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml共四個(gè)水平，每個(gè)水平單獨(dú)測(cè)定5次，回收率為85.0%～94.0%，變異系數(shù)均小于4.8%，見表1。

表1 百草枯回收率和精密度試驗(yàn) (n=5；μg/ml)

1.7 百草枯測(cè)定方法的特異性和穩(wěn)定性 選取百草枯中毒患者與健康人血漿各20人份，為中毒組與對(duì)照組，均加入20%高氯酸甲醇溶液高速離心，分離血漿蛋白，操作按照1.2血樣處理及試驗(yàn)方法進(jìn)行。中毒組的血漿中百草枯最大吸收峰均為(605±1)nm，對(duì)照組不顯色，掃描無吸收峰，表明方法的特異性良好。上清液加入連二亞硫酸鈉、碳酸氫鈉后顯藍(lán)色，但藍(lán)色會(huì)很快褪色，當(dāng)加入飽和氫氧化鈉液后，會(huì)明顯增加藍(lán)色深度，提高了試驗(yàn)方法的靈敏度。穩(wěn)定性試驗(yàn)：每隔2 min掃描一次吸光度，觀察吸光度的變化，10 min內(nèi)無褪色，10 min后開始逐漸褪色，表明該試驗(yàn)在顯色10 min內(nèi)顯色穩(wěn)定，所以應(yīng)在10 min內(nèi)完成比色，即可提高試驗(yàn)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。

1.8 監(jiān)測(cè)指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果對(duì)比 為了證實(shí)該方法的準(zhǔn)確性、可靠性，配置0.0、1.0、5.0、10.0 μg/ml的百草枯血漿標(biāo)本，按1.2樣品處理及試驗(yàn)方法操作。同時(shí)按照GA/T1629-2019監(jiān)測(cè)指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)配制試劑，對(duì)同一樣品進(jìn)行衍生化氣相色譜法分析和百草枯顯色紫外分光光度法分析，結(jié)果見表2。

表2 不同檢測(cè)方法測(cè)定血液百草枯的結(jié)果

2 討 論

堿性的連二亞硫酸鈉可將百草枯還原成藍(lán)色的自由基，臨床上利用百草枯這一理化性質(zhì)，已應(yīng)用于尿液中的百草枯測(cè)定[3-6]。由于血液單位體積內(nèi)百草枯含量明顯低于尿液[7]，且送檢血液量也較少，且誤服百草枯后送檢樣本多為血液，血液中的百草枯測(cè)定往往需要?dú)庀嗌V法，液質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法等貴重儀器檢測(cè)，基層醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室很難做到，采用常規(guī)百草枯顯色測(cè)定，準(zhǔn)確性較差。所以如何準(zhǔn)確、快速檢測(cè)血液中的百草枯含量，對(duì)臨床救治非常重要。本研究對(duì)傳統(tǒng)血液百草枯測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)和探討，在血液離心后取血漿0.5 ml加20%高氯酸甲醇溶液后再次高速離心，上清液用碳酸氫鈉堿化和連二亞硫酸鈉顯色后，再加飽和氫氧化鈉溶液0.1 ml增色，pH>14，使血液中的百草枯測(cè)定靈敏度明顯提高，顯色穩(wěn)定性增強(qiáng)，結(jié)果顯示，飽和氫氧化鈉溶液對(duì)百草枯測(cè)定方法的穩(wěn)定性、靈敏度至關(guān)重要，只要準(zhǔn)確把握顯色時(shí)間，在10 min內(nèi)完成比色，即可保證試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性。

本研究還以蒸餾水做基線測(cè)量，在200～700 nm波長自動(dòng)掃描百草枯，可以排除血漿基質(zhì)對(duì)基線測(cè)量的干擾，防止出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百草枯吸收峰出現(xiàn)在紫外區(qū)(395±2)nm和可見光區(qū)(605±2)nm。選擇(605±2)nm為定性定量主峰，按本方法操作一旦在(605±2)nm處出現(xiàn)最大吸收峰，就表明血液中百草枯成分的存在。本研究通過百草枯回收率和精密度試驗(yàn)顯示：樣品加標(biāo)回收率為85.0%～94.0%，方法變異系數(shù)均小于4.9%，表明能夠滿足臨床中毒診斷的需要。百草枯濃度在0.05～40.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量檢測(cè)下限為0.05 μg/ml。

氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法等采用的儀器價(jià)格昂貴，樣品前處理繁瑣用時(shí)長，不適合突發(fā)事件的檢測(cè)，致使基層醫(yī)院乃至三甲醫(yī)院開展血液百草枯測(cè)定受限[4-6]。2018—2020年我院毒檢科共檢測(cè)265例百草枯中毒患者，誤服中毒92.1%(244/265)，意外中毒7.9%(21/265)。并抽取其中的100例進(jìn)行兩種方法對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果證明采用紫外分光光度法與氣相色譜法測(cè)定百草枯濃度檢測(cè)結(jié)果相同，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，無1例漏診誤診。證明紫外分光光度法準(zhǔn)確性高，且避免了氣相色譜衍生化中繁瑣的操作過程[8]，操作快速、簡便, 值得臨床推廣應(yīng)用。