◆作者：辛國芹

◆單位：山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

脂肪酶（Lipase）可以將脂肪分解成脂肪酸以及丙三醇，是脂肪消化利用最基本的酶（閆昭明等，2021）。其可提高飼料中油脂的消化吸收率，促進(jìn)機(jī)體健康。飼糧中添加300 mg/kg脂肪酶可改善京紅蛋雞產(chǎn)蛋后期肝臟的脂代謝，提高蛋雞產(chǎn)蛋率，改善蛋殼品質(zhì)和降低蛋黃膽固醇含量（彭簫等，2019）。吳先華等（2013）報(bào)道炎熱的夏季,在母豬日糧中添加0.03%脂肪酶，減少脂肪粉的使用，可改善母豬體況及乳成分；龔俊勇等（2021）研究發(fā)現(xiàn)羅非魚低脂日糧中添加100～200g/t脂肪酶可提高生長性能、血清生化及免疫指標(biāo)。自然界中普遍存在脂肪酶（Konwar B K，2018)，微生物產(chǎn)生的脂肪酶具有來源廣、生產(chǎn)期短、產(chǎn)量高、易提取、對(duì)外界環(huán)境要求低等特點(diǎn)（李唯一，2021）。

本研究旨在從林下土壤中通過平板篩選法篩選到一株產(chǎn)脂肪酶性能較好的菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。為后續(xù)產(chǎn)脂肪酶菌株的選育及脂肪酶未來可能的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)踐資料及科學(xué)依據(jù)，對(duì)脂肪酶的應(yīng)用和發(fā)展具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 分離源

泰山后山松樹林下土，采用多點(diǎn)混合土樣采集方法深度為2～10cm的土樣。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離平板培養(yǎng)基：三丁酸甘油酯平板（郭曉軍等，2015）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10 g，三丁酸甘油酯2 mL，瓊脂粉20g，水1000mL；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%，蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.12%，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.01%，pH自然。

1.1.3 主要試劑（趙興秀等，2016）

4%的聚乙烯醇（PVA）溶液：稱取40g聚乙烯醇于燒杯中，加入800mL蒸餾水，邊攪拌邊加熱，使其完全溶解，自然冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，然后用雙層紗布過濾，保存濾液備用。

脂肪乳化劑：取大豆油與聚乙烯醇(4%)按1∶3（V∶V）比例混合，用攪拌乳化5～8 min，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的初篩

稱取10g采集的土樣置于已滅菌的裝有90mL生理鹽水且含有玻璃珠的250mL三角瓶中振蕩處理30min。將土壤上清液混勻后取1mL用滅菌生理鹽水稀釋至10-4、10-5兩個(gè)稀釋度，分別用滅菌的移液管吸取0.1mL涂布于預(yù)先配制并且滅菌的平板分離培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)2d后至出現(xiàn)透明圈的菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)，直至鏡檢無雜菌后作為出發(fā)菌種，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，選出脂肪酶高產(chǎn)菌種。

1.2.2 菌株復(fù)篩

1.2.2.1 粗酶液的制備

將上述所得到的菌落接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)18h，然后將液體種子以2%接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。取發(fā)酵液5000 r/min離心10min，吸取上清液作為粗酶液。

1.2.2.2 脂肪酶活性測(cè)定

脂肪酶活力測(cè)定參見橄欖油乳化法（Macrae A R，1985）。

1.2.3 菌株鑒定

對(duì)篩選到的產(chǎn)酶性能較好的菌株進(jìn)行5.8SITS區(qū)序列測(cè)定，鑒定到屬，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹明確其分類地位。

1.2.3.1 菌株DNA的提取

待測(cè)菌株在種子培養(yǎng)基上。

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增和5.8S rDNA-ITS區(qū)序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增選用50μL反應(yīng)體系：Mixture25μL（含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司），引物ITS1和ITS4（濃度為25μmol/L）各1μL，模板DNA 2μL，超純水21μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng) 條件是：94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。將含有目的片段的PCR產(chǎn)物送北京博尚公司測(cè)序。

測(cè)得的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行多重序列比較，用MEGA3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的分離初篩

多采用多點(diǎn)混合土樣采集方法，采取深度為2～10cm深度松下土，并采用梯度稀釋及涂布法進(jìn)行產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選，初步分離得到12株產(chǎn)脂肪酶（出現(xiàn)透明反應(yīng)圈，如圖1所示）的菌株并進(jìn)行保存。

圖1 產(chǎn)脂肪酶菌株在三丁酸甘油酯平板上形成的水解圈

菌種篩選工作量大主觀性強(qiáng)，根據(jù)酶分解底物產(chǎn)生的水解圈來選擇目的菌株，既方便快捷又具有科學(xué)性。選擇透明圈較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩既嚴(yán)謹(jǐn)也可減少發(fā)酵復(fù)篩的工作量。菌株有很強(qiáng)的分解脂肪的能力，在富含脂質(zhì)的培養(yǎng)基上可以觀察到菌落周圍明顯的水解圈，這表明該酵母可以分泌產(chǎn)生大量的脂肪酶（Nicaud JM，2012）。

2.2 菌株的復(fù)篩

挑取平板上透明圈較大的6株菌接種至進(jìn)行液體發(fā)酵48h，采用橄欖油乳化法測(cè)定每個(gè)菌株產(chǎn)酶性能，結(jié)果如表1所示。

表1 6株菌產(chǎn)脂肪酶測(cè)定結(jié)果

如表所示，選取透明圈較大的菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)測(cè)定產(chǎn)脂肪酶性能較好的菌株為TS-2，在30℃、180rpm條件下培養(yǎng)48h，發(fā)酵液脂肪酶活為4.81 U/mL，高于胡玷君（等，2016）分離的芽孢桿菌發(fā)酵液脂肪酶為2.17 U/mL。

2.3 菌株TS-2鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株TS-2的生長特性

該菌株在孟加拉紅平板上30℃培養(yǎng)48h，菌落圓形、粉白色，表面干燥、邊緣整齊、質(zhì)干厚重。細(xì)胞單個(gè)、卵形、臘腸形,有假菌絲。菌落菌體形態(tài)如圖2所示。

圖2 菌株TS-2菌落特征及鏡檢圖片

2.3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用引物ITS1和ITS4，菌株TS-2擴(kuò)增到目的片段大小在600bp左右，如圖3所示。

圖3 菌株TS-2擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳

將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如下：

ACCTGCGGAACATTATTG ATTTTATTTATTTTTGTGGATTT TTATTTTATTACAGGGTCATTTT ATTTCAATTATTAACTATCAAC AACGGATTTTTTGGCTTTCACA TCGATGAAGAACGCAGCGAAC CGCGATATTTTTTGTGACTTGC AGATGTGAATCATCAATTTTTG AACGCACATTGCGCGGTATGG CATTCCGTACCGCACGGATGGAGGAGGGTGTTCC

CTTTGGGCATCG

CATTGCTTTCTTGAAATGGATTTTTTTAAACTCTCAATTATTACGTCATTCACTGGCTAATTCATCCGAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAACCCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCTTGGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGT

2.3.3 目的菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

目的菌株的5.8SrDNA ITS序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，利用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。

圖4 菌株TS-2的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)得菌株的5.8S rDNA-ITS區(qū)序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，調(diào)取它們相關(guān)的序列進(jìn)行分析。系統(tǒng)聚類分析發(fā)現(xiàn)它和解脂耶氏酵母菌Yarrowia lipolytica親緣關(guān)系最近相似度達(dá)99%，綜合以上菌株的菌落形態(tài)、生長特性、鏡檢形態(tài)及5.8S rDNA-ITS區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化分析證明菌株TS-2為解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）。

目前產(chǎn)脂肪酶的微生物主要有假單胞菌、金黃色葡萄球菌、伯克霍爾德氏菌、果味青霉、根際毛霉、柱狀念珠菌等（劉曉麗等，2018），但解脂耶氏酵母產(chǎn)脂肪酶的研究相對(duì)較少。本項(xiàng)目篩選到一株產(chǎn)脂肪酶性能較好的解脂耶氏酵母TS-2，該菌株生長速度快，營養(yǎng)需求低，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

3 總結(jié)

采用梯度稀釋涂布法及平板篩選法從松樹林下土初步分離得到12株產(chǎn)脂肪酶性能菌株。進(jìn)一步篩選到一株產(chǎn)脂肪酶性能較好的菌株TS-2，在30℃、180rpm條件下培養(yǎng)48h發(fā)酵上清液脂肪酶活可達(dá)4.8U/mL。綜合菌落形態(tài)、生長特性鏡檢形態(tài)及5.8SrDNA-ITS區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化分析證明所分離的菌株TS-2為解脂耶氏酵母酵母（Yarrowia lipolytica）。但該菌株目前尚未列入飼料添加劑品種目錄（2013），其在養(yǎng)殖終端的應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：（略）