◆作者：鄭勝蘭 耿士偉 尹原妍 賈書靜

◆單位：江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測試中心

洛克沙胂是一種有機(jī)砷制劑，易溶于甲醇、乙醇、乙酸、丙酮和堿溶液，微溶于冷水，可用于豬、雞促進(jìn)生長，并起到抗菌、抗球蟲的作用。作為飼料添加劑，洛克沙胂可使機(jī)體同化作用加強(qiáng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，改善皮膚營養(yǎng)，增強(qiáng)骨髓的造血機(jī)能，提高飼料報(bào)酬，改善胴體品質(zhì)（錢潮海等，2010；聶新志等，2008；趙春華等，2019）雖然洛克沙胂絕大多數(shù)以化合物形式隨糞便和尿液排出體外，但是在微生物氧化、礦物氧化和光解等條件下，它容易被轉(zhuǎn)化成高致毒性的無機(jī)砷，造成二次環(huán)境污染（A.J.Bednar等，2003；John F.Stolz等，2007；Irail Cortinas等，2006）。為保障動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全，維護(hù)公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全，農(nóng)業(yè)部于2018年1月發(fā)布農(nóng)業(yè)部第2638號公告，禁止在食品動(dòng)物中使用洛克沙胂。

目前，飼料中洛克沙胂的檢測遵循的標(biāo)準(zhǔn)是禁令頒布前的舊國標(biāo)GB/T 22146-2008。顯然，該標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)不能適應(yīng)當(dāng)前日常檢驗(yàn)的需求，急需重新制定新標(biāo)準(zhǔn)。在標(biāo)準(zhǔn)制定過程中，我們發(fā)現(xiàn)，按照原標(biāo)準(zhǔn)指定的方法操作時(shí)，有部分添加劑預(yù)混合飼料復(fù)溶加標(biāo)回收率表現(xiàn)不理想。因此，預(yù)混合飼料中洛克沙胂的檢測方法，特別是前處理過程亟待優(yōu)化。本文對預(yù)混合飼料的檢測方法，特別是前處理方法的部分進(jìn)行了較為深入的研究探索。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

甲醇（色譜純，默克）；乙腈（色譜純，默克）；甲醇（分析純，國藥）；甲酸（色譜純，美國ACS）；磷酸氫二鉀（分析純，滬試）；磷酸二氫鉀（分析純，滬試）；磷酸（分析純，滬試）；洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)品（98.5%，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）。

1.2 主要儀器和設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀，配有紫外檢測器檢測器（美國waters公司）；MAX固相萃取小柱（150 mg/6 mL，美國waters公司）；微孔濾膜（0.45μm，美國安捷倫公司）。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：水相為含有0.1%甲酸的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，有機(jī)相為乙腈，有機(jī)相+水相=9+91（體積比）；柱溫：30℃；檢測波長：266 nm；進(jìn)樣量：20μL

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取試樣2g，準(zhǔn)確至0.01g，置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20.00 mL 20 g/L磷酸氫二鉀溶液，振蕩提取20 min，離心10 min，取上清液5.00 mL于試管中，加入0.5 mL 10%磷酸水溶液，混勻備用。

1.4.2 凈化

固相萃取小柱依次用5 mL甲醇和5 mL水預(yù)淋洗，取備用液過柱，依次用5 mL水和5 mL 1%乙酸甲醇淋洗，吹干。用15%甲酸甲醇溶液5 mL洗脫，吹干，收集洗脫液，于50℃水浴下用氮?dú)獯蹈桑?.00 mL含有0.1%甲酸的10%甲醇溶液溶解，渦旋混勻，用0.45μm濾膜過濾，上機(jī)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇溶解定容得1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再以含有0.1%甲酸的10%甲醇溶液稀釋定容配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度 分別為：0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL。在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行測定，以洛克沙胂的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 檢出限和定量限

選取空白基質(zhì)，向其中加入一定濃度的洛克沙胂對照品，按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行測定，依據(jù)信噪比（s/n）≥3及信噪比（s/n）≥10的原則，確定本方法的檢出限和定量限。

1.7 方法回收率測定

稱取不同基質(zhì)的試樣2g，準(zhǔn)確至0.01g，置于50mL離心管中，加入洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液，使洛克沙胂在飼料中的添加量為5 mg/kg、10 mg/kg和50 mg/kg，按樣品前處理方法處理樣品后上機(jī)測定。以洛克沙胂的色譜峰面積代入回歸方程計(jì)算方法回收率。

1.8 精密度測定

樣品處理及測定方法同1.6節(jié)，每個(gè)添加水平作6份平行測定，求得日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差；選取洛克沙胂添加水平為10 mg/kg的加標(biāo)樣，連續(xù)測定3天，求得日間標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相條件優(yōu)化

因?yàn)轱暳蠘悠返碾s質(zhì)較多，為獲得更好的分離選用長柱。在流動(dòng)相水相的選擇上，通過查找相關(guān)文獻(xiàn)和對目標(biāo)物性質(zhì)的分析，確定以含有0.1%甲酸的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相的水相（張莉等，2014；中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，2008）。流動(dòng)相中有機(jī)相的選擇上，比較了甲醇和乙腈，結(jié)果表明由于乙腈的洗脫能力更強(qiáng)，以乙腈為有機(jī)相時(shí)，目標(biāo)峰的出峰時(shí)間稍有提前，并且能更好的避開雜峰。最后確定流動(dòng)相條件為有機(jī)相+水相=9+91(體積比)。在該條件下，洛克沙胂的峰形較好，與雜質(zhì)峰分離良好，未見明顯干擾，標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 1μg/mL洛克沙胂典型色譜圖

圖2 5mg/kg洛克沙胂添加量的復(fù)合預(yù)混合飼料（紅線）和空白樣品（黑線）的色譜圖

2.2 淋洗液和洗脫液的選擇

與文獻(xiàn)報(bào)道類似，我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)混合陰離子固相萃取柱更適合于有機(jī)酸的凈化富集。取5 mL 10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液過已活化的MAX小柱，接柱后液上機(jī)測試，目標(biāo)峰位置未出峰，表明目標(biāo)物被有效的保留于小柱上。

同時(shí)，以分段分析的方式考察淋洗液和洗脫液。各取濃度為10μg/mL的洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液分別過5個(gè)已活化的MAX小柱，分別以5 mL的純水、甲醇、5%甲酸甲醇、10%甲酸甲醇、15%甲酸甲醇淋洗，收集柱下液混勻后上機(jī)測試，將測得的目標(biāo)峰峰面積與10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的比值計(jì)算一次洗脫率。再次以上述淋洗液重復(fù)淋洗，收集柱下液混勻后上機(jī)測試，將測得的目標(biāo)峰峰面積與10μg/mL洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積的比值計(jì)算二次洗脫率，結(jié)果如表1所示。

表1 不同溶液對洛克沙胂的洗脫效率

由表1可得出以下三點(diǎn)結(jié)論：首先，純水、甲醇對富集于小柱上的目標(biāo)物沒有洗脫能力，可以作為淋洗液；第二，5%甲酸甲醇兩次洗脫均不能將目標(biāo)物完全洗脫下來，而將濃度提升至10%和15%則可一次有效洗脫目標(biāo)物；第三，在確定的淋洗液和洗脫液條件下，增加洗脫體積對結(jié)果不產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響。

我們連續(xù)5天跟蹤測定了10%甲酸甲醇溶液的pH值并重復(fù)洗脫率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，隨著時(shí)間的推移，溶液的pH值逐漸增大，而其對洛克沙胂的洗脫能力逐漸減弱。這主要是由于洛克沙胂的pKa1與甲酸的pKa值極為接近（分別為3.5和3.75），甲酸甲醇溶液pH值的微小變化將影響洛克沙胂與固定相之間的相互作用能力。而洛克沙胂為酸類物質(zhì)，洗脫溶液pH越小，目標(biāo)物越容易從柱子上洗脫下來。但是，15%甲酸甲醇溶液放置一個(gè)月后pH值仍然保持在3.5左右，對洛克沙胂的一次洗脫率也能夠穩(wěn)定在100%左右。因此，我們最后選擇以15%甲酸甲醇溶液作為洗脫液，洗脫體積為5 mL。

圖3 甲酸甲醇溶液pH值變化與洗脫率的關(guān)系

2.3 提取液的選擇

由于洛克沙胂易溶于甲醇和稀堿，在水中略溶解。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取甲醇、0.5%氨水甲醇、50%甲醇、10%甲醇、20g/L磷酸氫二鉀溶液共5種提取液，在10 mg/kg的添加水平下考察實(shí)際樣品中目標(biāo)物的提取效率。結(jié)果如表2所示。

由表2可知，含有機(jī)相的提取劑不適用于添加劑預(yù)混合飼料中洛克沙胂的提取。分析原因可能有兩個(gè)：第一，有機(jī)相的存在影響了飼料基質(zhì)中銅、鐵、錳、鋅等元素的溶解，而這些存在于沉淀中的帶正電的物質(zhì)吸附了帶負(fù)電目標(biāo)物，起到了類似固定相的作用；第二，預(yù)混合飼料的輔料大多為石粉、沸石粉等無機(jī)礦物質(zhì)，這類物質(zhì)在有機(jī)相中的浸潤性相對較差，不利于目標(biāo)物的提取。綜上，20g/L磷酸氫二鉀溶液對添加劑預(yù)混合飼料的提取效率均較為滿意，可作為添加劑預(yù)混合飼料的提取液。

表2 不同提取液對回收率的影響

2.4 上柱溶液pH值的考察

分別稱取7份試樣各2 g，準(zhǔn)確至0.01 g，置于50 mL離心管中，加入洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液，使洛克沙胂在飼料中的含量為2 mg/kg，準(zhǔn)確加入20.00 mL 20 g/L磷酸氫二鉀溶液，振蕩提取20 min，離心10 min，分別取上清液5.00 mL于7個(gè)試管中，分別以10%磷酸水溶液調(diào)節(jié)樣液pH值為7、5、4.5、3.5、3、2.5和2，混勻，上柱凈化后上機(jī)。以洛克沙胂的峰面積代入回歸方程計(jì)算方法回收率，所得結(jié)果如圖4所示。

圖4 上樣液pH值對回收率的影響

由圖可知，當(dāng)上柱液pH≥5時(shí)，目標(biāo)物的回收率為0，隨著上樣液pH值的降低，回收率也逐漸提高，當(dāng)樣液pH=3時(shí)，回收率達(dá)到90%，繼續(xù)降低pH值對回收率基本沒有影響。因此確定調(diào)節(jié)上柱液的pH≤3。在日常檢測中，如果每個(gè)樣品上清液都要調(diào)節(jié)pH值，不易實(shí)現(xiàn)批量操作。通過對多種復(fù)合預(yù)混料、維生素預(yù)混料和微量元素預(yù)混料綜合考察發(fā)現(xiàn)，500μL 10%磷酸水溶液均能將5 mL上清液的pH值調(diào)節(jié)到＜3。最后確定通過向5mL上清液中加入500μL 10%磷酸水溶液的方式調(diào)節(jié)樣液pH值后上柱凈化。

分析原因：不同飼料樣品經(jīng)過堿性的磷酸氫二鉀溶液提取后上清液的pH值在7～8，而洛克沙胂在堿性水溶液環(huán)境下目標(biāo)物帶負(fù)電，不易在固相萃取柱中保留下來。調(diào)節(jié)上清液的pH值小于pKa值，洛克沙胂帶正電，目標(biāo)物能在固相萃取柱上有效保留。

2.5 飼料中洛克沙胂檢測的工作曲線、相關(guān)系數(shù)（r）、檢測限（LOD）

洛克沙胂在0.5～20.0μg/mL范圍內(nèi)線性良好，工作曲線及相關(guān)參數(shù)見表3。

表3 飼料中洛克沙胂檢測的線性方程，相關(guān)系數(shù)（R2）、檢出限和定量限

2.6 回收率和精密度

預(yù)混合飼料中洛克沙胂測定的回收率和日間與日內(nèi)精密度見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在三種飼料基質(zhì)中，低、中、高3個(gè)添加水平的回收率在85.9%～93.4%。日內(nèi)測定的RSDintra（n=6）在3.6%～7.6%，日間測定的RSDinter（n=3）在4.3%～8.6%。

表4 回收率和日內(nèi)、日間標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了預(yù)混合飼料中洛克沙胂的測定方法，以磷酸氫二鉀溶液為提取液，上清液經(jīng)10%磷酸水溶液調(diào)節(jié)pH后上MAX小柱凈化，吹干后以含有0.1%甲酸的10%甲醇水溶液復(fù)溶后上機(jī)檢測，優(yōu)化后的方法精密度高，回收率好。相對于原方法，增加了調(diào)節(jié)上柱液pH值的過程，并且改變了洗脫液的配比，在回收率和精密度上都有了極大的提高，基本能夠完全滿足日常檢測的需求。

洛克沙胂禁用之后，對檢測的靈敏度有更高的要求，下一步我們將基于目前的樣品前處理方法，開發(fā)適用于洛克沙胂測定的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法。

參考文獻(xiàn)：（略）