楊樹寶，張桂山，徐 晶，張英楠,3* (.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林市 3203；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 308；3.長(zhǎng)春科技學(xué)院 生命科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 30600)

呼吸道相關(guān)性淋巴組織(RALT)是黏膜相關(guān)性淋巴組織(MALT)的重要組成部分，MALT同時(shí)也包括腸道相關(guān)淋巴組織以及泌尿生殖道相關(guān)淋巴組織[1]。由于雞沒有外周淋巴結(jié)，所以MALT成為主要的次級(jí)免疫器官，對(duì)禽類的免疫保護(hù)起重要作用[2]。伴隨著呼吸道結(jié)構(gòu)和功能的一系列轉(zhuǎn)變，RALT也發(fā)生著相應(yīng)的變化。由于雞出殼后需要立即呼吸，從而呼吸道會(huì)接觸到與成雞接觸類型一致的混于空氣中的微生物群，且極有可能接觸到病原菌，而此時(shí)的雛雞呼吸道并未建立獲得性免疫的保護(hù)，雞在出殼后，母源抗體非常有限，因此，雞如何在出殼初期保護(hù)自身不受病原體侵?jǐn)_，RALT發(fā)育及功能是否成熟，能否給呼吸道及機(jī)體提供免疫保護(hù)等問題值得研究。

IL-2是由激活的Th1細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一類重要細(xì)胞因子之一，能抑制Th2型細(xì)胞發(fā)育，選擇性增強(qiáng)Th1型細(xì)胞分化增殖，亦能誘導(dǎo)T、B細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤的作用[3]。IFN-γ是由活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等分泌的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物活性的重要細(xì)胞因子，能直接促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的分化，增強(qiáng)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)，是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，常被用作感染機(jī)體的細(xì)胞介導(dǎo)免疫的指示器[4]。由于Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中起主要作用的是細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ，因此本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)不同時(shí)期RALT中IL-2和IFN-γ mRNA的表達(dá)水平，在一定程度上反映不同時(shí)期雞RALT的細(xì)胞免疫功能變化情況，從而為研究雞出殼初期的免疫機(jī)制及雞呼吸道疾病(尤其是禽流感)的防治以及研制有效的鼻腔免疫疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物200枚海蘭褐蛋雞SPF種蛋，購(gòu)自吉林卓越生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器RNAisoTMPlus、PrimeScript RT-PCR Kit、pMD?18-T 載體和SYBR?PrimeScript RT-PCR KitⅡ均購(gòu)自大連寶生物；AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 50-prep購(gòu)自美國(guó)AXYGEN BIOSCIENCES；E.N.Z.A?Gel Extraction Kit 購(gòu)自O(shè)mega公司。

依愛EIF/C.DME3456孵化機(jī)/出雛機(jī)(中國(guó))，NanoDrop 超微量高精度紫外/可見光光度計(jì)，Eppendorf 冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，Eppendorf AG，22331Hamburg梯度PCR儀，ABI Applied Biosystems StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登錄的chIL-2、chIFN-γ和chβ-actin的序列，在保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 IL-2、IFN-γ和β-actin的特異性引物

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)利用孵化器對(duì)種蛋進(jìn)行孵化，孵化溫度：37.5～38.2℃，濕度：60%～70%，每2 h自動(dòng)翻蛋1次，出殼后，雛雞進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。分別在15，18，20胚齡及1，4，7，14，21，35，56，90日齡，每個(gè)時(shí)期分別取5只雞胚或雛雞的氣管、喉和肺臟等組織，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄按照RNAisoTMPlus (D9108A)說明書提取雞呼吸道各段組織的總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR037A)說明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.6 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備以35日齡雛雞的肺臟cDNA為模板，對(duì)IL-2、IFN-γ和β-actin基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，目的基因經(jīng)1%凝膠電泳后按照E.N.Z.A?Gel Extraction Kit說明書進(jìn)行回收純化，然后將回收純化后的IL-2、IFN-γ和β-actin DNA與pMD 18-T載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化至宿主感受態(tài)菌DH5α，將IL-2 、IFN-γ和β-actin陽性克隆進(jìn)行序列鑒定，測(cè)序結(jié)果與在GenBank中登錄的雞IL-2 mRNA (AF000631)，IFN-γ mRNA (X99774)及β-actin mRNA (X00182)的保守序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用DNAStar進(jìn)行同源性分析。用核酸蛋白分光光度計(jì)測(cè)定IL-2、IFN-γ和β-actin DNA片段的陽性質(zhì)粒D值，按照以下公式計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)：

ds DNA拷貝數(shù)=

每一種陽性質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍滴度稀釋，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用SYBR GreenⅠ熒光染料法，以IL-2、IFN-γ和β-actin陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋(1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5)濃度為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。不斷對(duì)模板濃度、引物濃度和退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化，以出現(xiàn)最小Ct值和最高熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，最后計(jì)算Ct值，取5個(gè)點(diǎn)繪制3個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 樣品中目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)將方法1.5中得到的不同日齡呼吸道各段組織的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，以檢測(cè)IL-2和IFN-γ mRNA的含量。各基因的反應(yīng)體系均為20 μL，反應(yīng)條件：95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。

1.9 結(jié)果分析以20胚齡雞胚呼吸道RALT中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平為1，根據(jù)各時(shí)期IFN-γ和IL-2基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平與20胚齡目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的差異倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從而闡明不同發(fā)育階段雞RALT中IFN-γ和IL-2基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 IL-2基因mRNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化由圖1A可見，胚胎時(shí)期肺臟中IL-2基因mRNA表達(dá)水平較低，且無明顯變化，出殼后1日齡時(shí)其表達(dá)水平明顯增加，約為胚胎時(shí)期的2倍。7～21日齡，IL-2基因mRNA表達(dá)水平持續(xù)顯著增加(P<0.05)，到21日齡時(shí)其表達(dá)水平是胚胎時(shí)期的60倍左右，達(dá)到高峰。35日齡時(shí)雖有所下降，但56，90日齡時(shí)又上升至接近21日齡時(shí)的表達(dá)水平。

由圖1B可見，喉RALT中IL-2的mRNA表達(dá)水平在胚胎時(shí)期和出殼后1日齡時(shí)均較低，4日齡時(shí)增加至胚胎20日齡表達(dá)水平的3倍，14日齡時(shí)，其表達(dá)水平較之前日齡顯著增加(P<0.05)，達(dá)到峰值。隨后的21，35日齡較14日齡的表達(dá)水平下降，56，90日齡時(shí)雖有所增加，但是仍然低于14日齡。

A.肺臟;B.喉圖1 不同發(fā)育階段雞RALT中IL-2基因mRNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化

本試驗(yàn)在所有日齡組雞的氣管中均未檢測(cè)到IL-2 mRNA的表達(dá)。

2.2 IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化由圖2A可見，胚胎時(shí)期肺臟中IFN-γ mRNA的表達(dá)水平較低，1，7日齡時(shí)較胚胎時(shí)期增加10～20倍，14日齡時(shí)又比1日齡高出近35倍，但21日齡時(shí)又比14日齡顯著下降(P<0.05)，此后日齡的表達(dá)水平又迅速增加，尤其是56日齡比14日齡高出3倍左右。

由圖2B可見，喉中IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平在胚胎期和出殼后1日齡時(shí)均較低，4日齡時(shí)比胚胎20日齡顯著增加了13倍(P<0.05)，7日齡時(shí)明顯下降，但14日齡又增加至與4日齡接近的表達(dá)水平，此后至35日齡，表達(dá)水平無明顯變化。56日齡時(shí)，其表達(dá)水平突然增加至4日齡時(shí)的20倍左右，而90日齡時(shí)又顯著下降(P<0.05)。

A.肺臟；B.喉；C.氣管圖2 不同發(fā)育階段雞RALT中IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化

由2C可見，胚胎時(shí)期一直到出殼后14日齡，氣管中IFN-γ的表達(dá)水平均比較接近，且表達(dá)量都很低，21～56日齡時(shí)，表達(dá)水平逐漸增加，但是變化幅度較小，56日齡時(shí)，表達(dá)水平大概是胚胎20日齡時(shí)的4倍左右，但90日齡時(shí)，表達(dá)水平迅速增長(zhǎng)至43倍左右。

2.3 不同器官中IL-2和IFN-γ mRNA表達(dá)水平變化規(guī)律的比較由圖3A可見，鼻、喉和肺臟中IL-2 mRNA表達(dá)水平隨著日齡增長(zhǎng)，整體變化趨勢(shì)相似，均隨著日齡增長(zhǎng)表達(dá)水平逐漸增加，并在21日齡時(shí)基本穩(wěn)定。其中，各日齡鼻和喉中IL-2 mRNA表達(dá)水平比較接近，且表達(dá)水平均較低，隨日齡增長(zhǎng)，變化幅度較小，而肺臟中IL-2 mRNA表達(dá)水平從7日齡開始就顯著高于鼻和喉，21日齡時(shí)表達(dá)水平比鼻和喉高10倍左右。

由圖3B可見，各日齡鼻、喉、氣管和肺臟中IFN-γ mRNA表達(dá)水平變化趨勢(shì)與IL-2相似，隨著日齡增長(zhǎng)表達(dá)水平逐漸增加，且4種器官中以肺臟表達(dá)水平最高，而氣管最低，鼻和喉接近，并在56，90日齡時(shí)達(dá)到較高表達(dá)水平，但仍顯著低于肺臟。

A.IL-2；B.IFN-γ圖3 不同器官中IL-2和IFN-γ mRNA表達(dá)水平的變化規(guī)律

2.4 不同發(fā)育階段雞同一RALT中IL-2和IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平的比較由圖4A可見，胚胎20胚齡和出殼后1～7日齡時(shí)肺臟中IL-2和IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平均比較接近，但從14～90日齡，各時(shí)期IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平均遠(yuǎn)高于IL-2，特別是14，56，90日齡IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平分別高于IL-2 10，30倍左右。

由圖4B可見，除4日齡時(shí)IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平顯著高于IL-2 4倍左右外，其他各個(gè)時(shí)期喉RALT中的IL-2和IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平均比較接近。此外，由于56日齡時(shí)IFN-γ的增加倍數(shù)太高，如果與其他日齡列在同一圖中，會(huì)影響IL-2和IFN-γ的直觀比較，故56日齡并沒有反映到圖4B中，但實(shí)際56，90日齡時(shí)IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平高于IL-2近48倍。

由于本試驗(yàn)在所有日齡組雞的氣管中均未檢測(cè)到IL-2 mRNA的表達(dá)，所以無法與IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較。

A.肺臟；B.喉圖4 不同發(fā)育階段雞RALT中IL-2和IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

目前，大多數(shù)關(guān)于呼吸道免疫系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)都是基于形態(tài)學(xué)的研究，對(duì)其免疫功能的研究在很大程度上也僅限于闡明抗原特異性抗體的反應(yīng)，而對(duì)于正常雞呼吸道淋巴組織中細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)研究較少。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期雞呼吸道淋巴組織中Th1細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的mRNA表達(dá)情況，從分子水平闡述雞呼吸道淋巴組織免疫功能的建立，從而了解不同時(shí)期雞呼吸道的免疫狀態(tài)。

IL-2是最重要的細(xì)胞因子之一，具有廣譜的免疫增強(qiáng)活性，主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞的增殖分化，并可促進(jìn)NK細(xì)胞的功能，能抑制Th2型細(xì)胞發(fā)育，選擇性增強(qiáng)Th1型細(xì)胞分化增殖，具有顯著的抗腫瘤、抗病毒的作用。IFN-γ是由活化的T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等分泌的一種低分子可溶性糖蛋白[5]。IFN-γ是由活化的NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等分泌的一種低分子可溶性糖蛋白，可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞、NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，能直接作用于T、B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)分化。此外，IFN-γ是一種免疫調(diào)節(jié)的多效性因子，哺乳動(dòng)物和家禽IFN-γ被用作感染機(jī)體的細(xì)胞介導(dǎo)免疫的指示器[6]。本研究通過對(duì)不同發(fā)育時(shí)期執(zhí)行并調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的關(guān)鍵細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胚胎時(shí)期呼吸道淋巴組織中細(xì)胞因子的表達(dá)水平極低，即可以認(rèn)為不表達(dá)，但在出殼后隨著生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)水平逐漸增加，并且在7，14日齡時(shí)迅速增加至較高水平，并在21日齡時(shí)基本達(dá)到峰值，且各時(shí)期IFN-γ的表達(dá)水平都遠(yuǎn)高于IL-2，這說明，隨著生長(zhǎng)發(fā)育呼吸道淋巴組織的細(xì)胞免疫功能逐漸增強(qiáng)，在出殼初期的1,2周內(nèi)增加尤為顯著，并且在21日齡時(shí)基本達(dá)到成熟水平，另外IFN-γ將在呼吸道淋巴組織執(zhí)行細(xì)胞免疫功能的過程中發(fā)揮主要作用。

CD4+輔助性T細(xì)胞主要包括Th1和Th2 2個(gè)亞群，Th1細(xì)胞對(duì)樹突狀細(xì)胞(DC)呈遞的抗原和B細(xì)胞通過共刺激分子呈遞的抗原應(yīng)答性最好，DC通過分泌IL-12和IL-18刺激Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α和TNF-β[7]?；罨妮o助性T細(xì)胞通過免疫突觸高度定向地分泌IL-2和IFN-γ。Th1型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括IFN-γ和IL-2等，與CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞( CTL) 的增殖、分化和成熟有關(guān)，能促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，抵抗胞內(nèi)病原菌和病毒感染[8-10]。本研究對(duì)喉、氣管和肺臟3種器官中IL-2和IFN-γ mRNA表達(dá)水平的比較發(fā)現(xiàn)，肺臟的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他器官。有研究表明肺臟在胚胎期就出現(xiàn)較多抗原呈遞細(xì)胞-MHC-Ⅱ+細(xì)胞[11]，由于表達(dá)MHC-Ⅱ+分子的DC細(xì)胞能夠促進(jìn)IL-2和IFN-γ的分泌，所以肺臟中有較高水平的IL-2和IFN-γ mRNA表達(dá)水平。另外課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肺臟在35日齡之前T淋巴細(xì)胞以CD4+細(xì)胞為主，而之后以CD8+細(xì)胞為主[12]，這也與本研究所觀察到的IL-2和IFN-γ mRNA表達(dá)水平逐漸增加相關(guān)，即CD4+細(xì)胞數(shù)量的增加能夠分泌更多的IL-2和IFN-γ，而IL-2和IFN-γ又能不斷促進(jìn)CD8+細(xì)胞的增殖和分化，因此CD8+細(xì)胞逐漸增多，并在35日齡時(shí)數(shù)目超過CD4+細(xì)胞。

綜上所述，本研究結(jié)果表明隨著生長(zhǎng)發(fā)育RALT的細(xì)胞免疫功能逐漸增強(qiáng)，且在21日齡時(shí)基本達(dá)到成熟水平。另外，各時(shí)期IFN-γ的表達(dá)水平均遠(yuǎn)高于IL-2，說明IFN-γ將在呼吸道淋巴組織執(zhí)行細(xì)胞免疫功能的過程中發(fā)揮主要作用。