邵順成，閆背背，張?zhí)炻劊?鵬，鄒詩凡，李新海，馮登偵 (寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750000)

我國綿羊品種豐富，但多羔品系較少，為了適應(yīng)現(xiàn)代養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)的需求，必須要有完整的良種繁育體系，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，提高品種的利用價值。傳統(tǒng)育種方法獲得遺傳進(jìn)展的速度緩慢，而利用標(biāo)記性輔助選擇可以進(jìn)行早期選種，從而提高選擇強(qiáng)度及效率。利用分子標(biāo)記手段對綿羊進(jìn)行選育，培育出多羔和具有優(yōu)良生產(chǎn)性能的綿羊品種(系)的任務(wù)仍十分必要。

雌激素是動物體內(nèi)重要的激素之一，參與了免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌和心血管等系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)，有多種生理作用，但要結(jié)合相應(yīng)的受體才能發(fā)揮其生物學(xué)作用。雌激素受體(estrogen receptor,ESR)屬轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族成員，主要由經(jīng)典的ESR1、ESR2以及新型的G蛋白耦聯(lián)雌激素受體1(GPER1)組成。ESR1又叫ERα，其通過與雌激素結(jié)合，形成配體遷移至細(xì)胞核，結(jié)合特定的反應(yīng)元件來調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，從而在相應(yīng)的靶組織表達(dá)調(diào)控[1]。ESR2基因首次在大鼠的前列腺組織中發(fā)現(xiàn)，主要在前列腺的上皮細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)， ESR2蛋白與ESR1蛋白DNA結(jié)構(gòu)域同源性為95%，配體結(jié)合域同源性為55%，因具有高度的同源性，故將該蛋白命名為ERβ[2]。綿羊ESR2基因位于7號染色體，共編碼527個氨基酸，屬于非跨膜蛋白，廣泛表達(dá)于全身各組織，如：子宮、卵巢、結(jié)腸、前列腺、肺和膀胱等[3]。研究發(fā)現(xiàn)ESR2基因在卵泡形成和排卵中起關(guān)鍵作用，若敲除小鼠ESR2基因外顯子4區(qū)域，可抑制小鼠排卵，原因是外顯子4區(qū)域含有DNA結(jié)合域，DNA結(jié)合域?qū)β雅莩墒旌团怕延兄陵P(guān)重要的作用[4]。研究表明，ESR2基因可以調(diào)控動物的繁殖性狀，如ESR2在家禽卵巢中表達(dá)量與產(chǎn)蛋性能有一定的關(guān)聯(lián)性[5-6]；同時ESR2基因也被證實(shí)是調(diào)控豬高產(chǎn)仔數(shù)的基因之一[7-8]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ESR2基因也是影響綿羊多產(chǎn)的候選基因之一，使用ESR2進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇可增加綿羊的產(chǎn)仔數(shù)，對養(yǎng)羊業(yè)具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[9]。

本試驗(yàn)以杜泊羊、灘寒羊、雜一代、雜二代和橫交一代5個綿羊群體為研究對象，基于Ensembl數(shù)據(jù)庫中已有的ESR2基因的錯義突變位點(diǎn)，通過 Sequenom Mass ARRAY?SNP 技術(shù)對5個綿羊群體ESR2基因g.73323973C>T、g.73326795G>A和g.73353489C>A 3個位點(diǎn)進(jìn)行檢測，并進(jìn)行產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析；利用相關(guān)生物信息學(xué)工具對突變前后二級結(jié)構(gòu)和蛋白互作等進(jìn)行分析與預(yù)測，以期為進(jìn)一步研究綿羊ESR2基因的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料共采集5個綿羊群體共768只綿羊的血樣，其中有產(chǎn)羔數(shù)記錄的599只(表1)，各群體血緣比例關(guān)系見表2。受試羊群均為母羊，購自寧夏宇泊科技有限公司。所有羊只進(jìn)行頸靜脈采血5 mL，加入EDTA-K2抗凝真空采血管 (江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司)中，-20℃保存。同時記錄各群體母羊的產(chǎn)羔季節(jié)、胎次與產(chǎn)羔數(shù)。

表1 試驗(yàn)羊群信息

表2 各群體血緣比例關(guān)系

1.2 綿羊基因組DNA提取使用血液DNA提取試劑盒(北京天根科技有限公司)對綿羊血液樣本DNA進(jìn)行提取，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，利用NanoDrop 2000超微量分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測5個綿羊群體血液DNA的純度、濃度和完整性。

1.3 基因分型采用Mass ARRAY Assay Design 3.1軟件設(shè)計檢測ESR2基因3個位點(diǎn)的單堿基延伸引物和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序。

1.5 生物信息學(xué)分析通過SOPMA工具(http://npsaprabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)分析ESR2蛋白的二級結(jié)構(gòu)；運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，設(shè)置為高置信度0.7，構(gòu)建與綿羊ESR2蛋白相互作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 ESR2基因3個位點(diǎn)在5個群體中的分型結(jié)果由圖1可見，ESR2基因g.73323973C>T位點(diǎn)在D、F1、F2、H1、TH 5個群體中有CC、TC和TT 3種基因型；g.73353489C>A位點(diǎn)在D、F1、F2、H1、TH 5個群體中有CC、CA和AA 3種基因型；g.73326795G>A位點(diǎn)在5個群體中有AA、GA和GG 3種基因型。

g.73323973C>T g.73326795G>A g.73353489C>A圖1 ESR2基因3個位點(diǎn)在5個群體中的分型結(jié)果

2.2 5個群體ESR2基因不同位點(diǎn)的基因多態(tài)性分析ESR2基因g.73323973C>T位點(diǎn)在5個群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)；該位點(diǎn)在5個群體中的優(yōu)勢等位基因?yàn)镃，除在D群體中的優(yōu)勢基因型為TC，在其他4個群體中的優(yōu)勢基因型為CC；各群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。g.73353489C>A位點(diǎn)在5個群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)；各群體優(yōu)勢等位基因均為C，優(yōu)勢基因型為CC；該位點(diǎn)除D羊群體外，在其他4個群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。g.73326795G>A位點(diǎn)在TH群體中表現(xiàn)為低度多態(tài)，在D、F1、F2、H1群體中表現(xiàn)為中度多態(tài)；該位點(diǎn)在5個群體中的優(yōu)勢等位基因?yàn)锳，除在D群體中的優(yōu)勢基因型為AG，在其他4個群體中的優(yōu)勢基因型為AA；各群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.3 ESR2基因3個位點(diǎn)各基因型與5個綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系對ESR2基因3個位點(diǎn)的不同基因型與5個群體產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，g.73323973C>T位點(diǎn)在TH群體中與產(chǎn)羔數(shù)有一定的關(guān)聯(lián)性，其中TT型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TC、CC型(P<0.01)，說明g.73323973C>T位點(diǎn)適用于TH群體多羔性狀的選育。g.73326795G>A、g.73353489C>A 2個位點(diǎn)各基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異均不顯著，不適用于5個綿羊群體多羔性狀的選育，詳情見表4。

表3 ESR2基因3個位點(diǎn)在5個群體中的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

表4 ESR2基因不同位點(diǎn)各基因型產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

2.4 生物信息學(xué)分析

2.4.1綿羊ESR2基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析 用SOPMA在線工具預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明參考蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋(alpha helix)占35.29%，無規(guī)卷曲(random coil)占53.13%，延伸鏈(extended strand)占8.16%，β-轉(zhuǎn)角(beta turn)占3.42%。而位點(diǎn)g.73323973C>T、g.73326795G>A和g.73353489C>A 3個位點(diǎn)的突變導(dǎo)致ESR2蛋白的 α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲和延伸鏈均發(fā)生了改變。

表5 蛋白質(zhì)突變前后二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 %

2.4.2綿羊ESR2蛋白相互作用 運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，設(shè)置為高信度0.7，構(gòu)建與綿羊ESR2蛋白相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)(圖2)。結(jié)果顯示，與ESR2蛋白相互作用的蛋白主要為NCOA家族、MAPA家族、SP1、NCOR1、SRC等相關(guān)蛋白。

圖2 綿羊ESR2蛋白的互作圖

3 討論

雌激素受體是配體依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬于配體激活轉(zhuǎn)錄因子中的一種核酸受體，不僅參與動物的繁殖性狀，研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體還參與相關(guān)病理活動，如心血管疾病、癌癥等，故在診療技術(shù)方面的研究有很大的潛力[10-11]。ANTONSON等[12]通過基因編輯技術(shù)敲除了小鼠ESR2基因，發(fā)現(xiàn)缺乏ESR2基因的母鼠繁殖率較低，并且可導(dǎo)致后代不育。同時發(fā)現(xiàn)ESR2基因完全喪失會導(dǎo)致母鼠卵巢變小，使卵泡的成熟及排卵均受到影響[13]。研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體在牛卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平隨著卵泡的發(fā)育，其表達(dá)量逐漸降低，故ESR2基因可能對牛的卵泡發(fā)育與排卵起重要作用[14]。國內(nèi)外學(xué)者對豬ESR2基因研究頗多，發(fā)現(xiàn)ESR2基因是影響豬產(chǎn)仔的主效基因之一，高天等[15]發(fā)現(xiàn)ESR2基因的外顯子1的A221G位點(diǎn)與嘉興黑母豬的產(chǎn)活仔數(shù)、總產(chǎn)仔數(shù)、初生均重以及死胎數(shù)顯著相關(guān)，為篩選母豬種群的高繁殖基因提供重要分子標(biāo)記。自Fecb基因已被證實(shí)可以提高綿羊的產(chǎn)羔數(shù)，為綿羊分子育種提供了重要分子標(biāo)記手段，所以繼續(xù)發(fā)掘與綿羊多羔相關(guān)的主效基因是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。ESR2基因作為影響動物繁殖性狀的基因之一，在綿羊上的研究也逐漸增多，如田志龍等[16]發(fā)現(xiàn)ESR2基因g.73324006C>T位點(diǎn)多態(tài)性與小尾寒羊前3胎產(chǎn)羔數(shù)及平均產(chǎn)羔數(shù)均顯著關(guān)聯(lián)，其中CC基因型各胎產(chǎn)羔數(shù)均高于TC基因型，并且ESR2基因在單羔小尾寒羊的垂體表達(dá)量顯著高于多羔小尾寒羊的垂體。

本研究團(tuán)隊(duì)初期對灘羊、小尾寒羊、杜泊羊和灘寒羊?yàn)檠芯繉ο?，利用飛行質(zhì)譜法技術(shù)對ESR2基因10個錯義突變位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測，探究不同品種綿羊ESR2基因的遺傳結(jié)構(gòu)，以期篩選出影響綿羊高繁殖力的關(guān)鍵位點(diǎn)，為綿羊選育提供分子標(biāo)記。結(jié)果顯示g.73323973C>T與g.73326795G>A位點(diǎn)在杜泊、小尾寒羊和灘寒羊中A基因頻率極顯著高于灘羊(P<0.01)，所以這2個位點(diǎn)可能是影響綿羊產(chǎn)多羔的候選位點(diǎn)；g.73353489C>A位點(diǎn)的T基因頻率在杜泊羊群體極顯著高于小尾寒羊、灘羊、灘寒羊(P<0.01)，可作為杜泊羊繁殖性狀選擇的候選基因[17]。基于此，本試驗(yàn)以5個綿羊群體為研究對象，對ESR2基因的3個多態(tài)位點(diǎn)展開研究，發(fā)現(xiàn)其同樣具有多態(tài)性。表型數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)對分子標(biāo)記育種起著至關(guān)重要的作用，產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)g.73323973C>T位點(diǎn)在灘寒羊群體中，TT基因型產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于TC和CC基因型(P<0.01)，表明g.73323973C>T位點(diǎn)突變后可能會引起灘寒母羊排卵數(shù)增加。同時在H1群體中發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)突變后，TT基因型產(chǎn)羔數(shù)均高于TC和CC基因型產(chǎn)羔數(shù)，但因H1群體TT基因型母羊樣本量較少，故后期要增加樣本量，再次進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

本研究的3個位點(diǎn)都屬于錯義突變位點(diǎn)，其突變前后均會引起氨基酸的改變。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)3個位點(diǎn)突變前后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)類型均發(fā)生了變化，結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致功能的變化。其中3個位點(diǎn)突變后均導(dǎo)致α-螺旋比例降低，使其穩(wěn)定性降低。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白主要與核受體輔激活蛋白 (nuclear receptor coactivator,NCOA)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等蛋白互作。其中NCOA蛋白又稱為類固醇受體輔激活蛋白，可以調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，會影響黃體的生成，NCOA1基因也被證實(shí)為動物繁殖性能候選基因之一[18-19]。從蛋白互作發(fā)現(xiàn)ESR2蛋白與多種信號通路中蛋白進(jìn)行互作，參與多種生理調(diào)控，但其互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用的相關(guān)機(jī)制有待深入研究。本研究為進(jìn)一步探討將ESR2基因應(yīng)用到多羔綿羊品系的培育中提供相關(guān)遺傳信息基礎(chǔ)。