曾雅惠,楊文艷,楊連玉 (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/吉林省動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué) 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130118)
銅(Cu)是生物體必不可少的過渡金屬元素,作為金屬酶的組成成分,直接參與體內(nèi)代謝、神經(jīng)遞質(zhì)合成、自由基清除等過程,對(duì)機(jī)體的生理功能和生長發(fā)育起著重要的作用[1-2]。高銅可促進(jìn)動(dòng)物生長,因此被作為添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧行業(yè)生產(chǎn)中,但高劑量的銅代謝緩慢,易導(dǎo)致動(dòng)物慢性銅中毒[3-6]。關(guān)于銅負(fù)荷的肝毒性、腎毒性、免疫抑制等導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷均有報(bào)道,亦有研究表明銅負(fù)荷對(duì)機(jī)體生殖系統(tǒng)的毒性作用也非常明顯[7-8]。李英等[9]研究發(fā)現(xiàn)高銅可引起銅在睪丸中沉積,影響精子數(shù)量及其活力,損傷雄性生殖。然而目前,母體銅營養(yǎng)水平是否對(duì)出生后其子代的生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能產(chǎn)生影響,尚未可知。因此本試驗(yàn)建立親代大鼠長期銅暴露模型,觀察子代大鼠睪丸組織形態(tài)、精子活力,探究親代不同銅水平對(duì)子代大鼠血清抗氧化指標(biāo)及睪丸功能的影響。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF清潔級(jí),健康程度良好、胎次相同、體質(zhì)量相近(44.04±3.05) g 的21日齡斷奶雌性SD大鼠24只,購自長春市寬城區(qū)宏達(dá)動(dòng)物養(yǎng)殖場。隨機(jī)分為3個(gè)日糧處理組,每組8只雌性大鼠,每天12 h光照,飼養(yǎng)溫度24℃,相對(duì)濕度50%,自由飲水采食。
1.2 主要試劑酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,飼料級(jí)含銅25% CuSO4·5H2O(廣澤,中國),PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa,日本),硝酸(HNO3),無水乙醇購自長春商貿(mào)添侯生物科技有限公司。
1.3 動(dòng)物模型及日糧設(shè)計(jì)3個(gè)日糧處理組分別飼喂A、B、C 3種不同銅水平日糧。A 組飼喂AIN-93G基礎(chǔ)日糧,B 組飼喂AIN-93G基礎(chǔ)日糧+CuSO4120 mg/kg,C組飼喂AIN-93G基礎(chǔ)日糧+CuSO4240 mg/kg。試驗(yàn)過程中,每天定時(shí)飼喂1次(17:00),自由采食和飲水,預(yù)飼7 d,試驗(yàn)期8周,與全同胞性成熟雄性SD大鼠和籠交配,妊娠后單籠飼養(yǎng),并繼續(xù)染銅至子代大鼠斷乳后。日糧配方見表1。
表1 日糧成分及營養(yǎng)水平 %
1.4 樣本采集及數(shù)據(jù)收集子代大鼠3周齡后,每組均繼續(xù)飼喂AIN-93G基礎(chǔ)日糧,待子代雄性大鼠10周齡每組隨機(jī)取8只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,分別標(biāo)記A0、B0、C0組??崭寡矍虿裳?,斷頸處死,分離雙側(cè)睪丸和附睪,左側(cè)分離后稱量睪丸和附睪濕重,計(jì)算臟器指數(shù),用于睪丸石蠟切片,右側(cè)于4℃預(yù)冷4%多聚甲醛中固定,用于組織銅的測定。附睪用于精液質(zhì)量檢測。
1.5 血清銅、睪丸組織銅的測定取1 mL血清樣品于三角瓶中,加5 mL濃HNO3和2 mL HClO4于電熱板上消煮至透明,有少量白煙。靜置冷卻,加2.5 mL 10% HNO3,轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中,用去離子水定容,搖勻待測,同時(shí)做空白試驗(yàn)。待測液用電感耦合等離子發(fā)射光譜(ICP-7500)測定。睪丸組織同上。
1.6 血清中抗氧化指標(biāo)的測定將血液離心,收集上清,試劑盒采用雙抗體夾心法測定大鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、銅藍(lán)蛋白(CP)水平,并嚴(yán)格按照說明書操作。
1.7 精液質(zhì)量檢測脫頸法處理大鼠后,切除附睪尾,用眼科剪剪開,置于1 mL預(yù)熱的PBS的離心管中,37℃培養(yǎng)箱孵育3 min,使精子游出,用精子稀釋液將精子懸液稀釋20倍,取10 μL稀釋后的精子懸液滴在精子計(jì)數(shù)板上在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù),用活動(dòng)的精子數(shù)與總精子數(shù)的比值表示精子活力。
1.8 睪丸組織的切片觀察左側(cè)睪丸組織于4%多聚甲醛中固定超過24 h后置于包埋盒中,在自動(dòng)脫水機(jī)中按照70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯Ⅱ的順序進(jìn)行脫水,用石蠟包埋,準(zhǔn)備切片,再用蘇木精-伊紅染色,用中性樹膠封片,最后在顯微鏡下觀察。
2.1 子代大鼠體質(zhì)量、睪丸濕重、附睪濕重、睪丸及附睪臟器指數(shù)由表2可知,子代大鼠體質(zhì)量、睪丸濕重、附睪濕重、睪丸臟器指數(shù)及附睪臟器指數(shù)隨著親代日糧銅水平的升高而降低,且與A0 組相比,C0組呈顯著降低趨勢(shì)(P<0.05)。附睪濕重B0組顯著低于A0組(P<0.05)。
表2 子代大鼠體質(zhì)量、睪丸濕重、附睪濕重、睪丸及附睪臟器指數(shù)的影響
2.2 血清銅、睪丸組織銅水平由圖1可知,子代大鼠血清銅、睪丸銅含量隨日糧銅水平的增加而增加。與A0組相比,B0組血清中銅含量顯著升高(P<0.05),C0組血清中銅含量極顯著升高(P<0.01)。與A0組相比,C0組睪丸中銅濃度顯著升高(P<0.05)。
注:與A0相比 *P<0.05;**P<0.01圖1 血清銅(左)、睪丸銅含量(右)
2.3 血清中抗氧化指標(biāo)的變化由表3結(jié)果可知,親代日糧添加120,240 mg/kg硫酸銅,能影響子代大鼠血清中抗氧化指標(biāo)水平,與A0組相比,親代添加240 mg/kg的硫酸銅能顯著降低子代大鼠血清GSH-Px、SOD水平(P<0.05),但均與B0組差異不顯著。與對(duì)照組相比,B0、C0組MDA水平均極顯著升高(P<0.01)。CP水平隨著銅水平增加呈上升趨勢(shì),且C0組顯著高于A0組(P<0.05)。
表3 子代大鼠血清抗氧化指標(biāo)
2.4 長期銅暴露對(duì)子代大鼠精子的影響由表4可知,子代大鼠精子數(shù)量、活動(dòng)率隨著親代染銅水平的升高而呈下降趨勢(shì)。與A0、B0組相比,C0組的精子數(shù)量和精子活動(dòng)率顯著降低(P<0.05);C0組的精子畸形率顯著高于A0、B0組(P<0.05)。
表4 大鼠精子數(shù)量、活力及畸形率
2.5 睪丸組織的形態(tài)學(xué)變化如圖2所示,A0組睪丸內(nèi)部結(jié)構(gòu)正常,生精小管基膜完整,B0組睪丸生精小管擴(kuò)張且排列松散,C0組睪丸發(fā)育不佳,生精小管基膜不完整,生精細(xì)胞排列層次不清晰,精子減少,睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)減少。
圖2 大鼠睪丸組織切片(HE × 200)
銅可以通過胎盤和母乳由母體向后代進(jìn)行轉(zhuǎn)移,胎兒的銅營養(yǎng)完全依賴于母體,妊娠期胎盤作為母體和胎兒之間物質(zhì)傳遞的紐帶,使銅在胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)過程中優(yōu)先供給胎兒,導(dǎo)致胎兒體內(nèi)銅的含量較高。HADDAD 等[10]研究發(fā)現(xiàn)用130 mg/kg硫酸銅飼喂妊娠期大鼠,其后代出現(xiàn)生長和發(fā)育遲緩的現(xiàn)象,本試驗(yàn)也獲得了相似的結(jié)果,不同銅水平日糧飼喂親代大鼠對(duì)子代雄性大鼠體質(zhì)量、睪丸濕重、睪丸系數(shù)有降低的趨勢(shì),但與吳國星等[11]的試驗(yàn)結(jié)果不同,這可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類及器官的敏感度不同導(dǎo)致。隨著日糧銅水平的提高和子代大鼠日糧采食時(shí)間的延長,血清和睪丸中的銅水平均呈升高的趨勢(shì),通過相關(guān)性分析表明,兩組數(shù)據(jù)顯著正相關(guān)。表明,親代飼喂不同水平銅日糧會(huì)導(dǎo)致銅在子代大鼠體內(nèi)蓄積,影響大鼠體質(zhì)量及組織濕重。
動(dòng)物日糧添加銅能顯著提高血清銅SOD活性[12],但高劑量的銅可引起機(jī)體組織的病理損傷,導(dǎo)致血清中Cu/Zn-SOD活性降低[13]。GSH-Px能將H2O2分解,產(chǎn)生水和O2,有效防止自由基的生成。血清銅95%是CP結(jié)合銅,CP具有氧化酶活性,由肝臟合成,并參與鐵代謝和運(yùn)輸銅,血清內(nèi)的CP水平會(huì)隨著銅攝入量的增加而顯著升高[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),親代覆蓋120,240 mg/kg的銅,子代大鼠血清中SOD和GSH-Px的活性均隨銅水平的增加而逐漸降低,而MDA含量和CP水平逐漸升高,且在親代添加240 mg/kg銅的子代大鼠中顯著升高,這可能是由于親代銅攝入增加了子代肝臟銅濃度,肝臟通過某一途徑繼續(xù)合成CP。MDA水平上升,意味著動(dòng)物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)可能受到破壞,動(dòng)物機(jī)體膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生損傷,提示親代大鼠長期銅暴露后,銅可通過胎盤屏障和血睪屏障進(jìn)入子代大鼠血清和睪丸內(nèi),引起催化類Fenton反應(yīng),導(dǎo)致氧化損傷。
睪丸是雄性動(dòng)物最為重要的生殖器官,主要由曲細(xì)精管和間質(zhì)構(gòu)成。曲細(xì)精管由支持細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞組成,前者對(duì)生殖細(xì)胞具有支持、保護(hù)和營養(yǎng)作用。有研究發(fā)現(xiàn),慢性銅暴露的小鼠睪丸組織出現(xiàn)嚴(yán)重的空泡化,曲細(xì)精管出現(xiàn)較大的不規(guī)則空隙,精原細(xì)胞和精母細(xì)胞數(shù)量減少,而睪丸系數(shù)無顯著性差異;此外,在高銅暴露的小鼠中發(fā)現(xiàn),精子的活力及運(yùn)動(dòng)能力下降,畸形率升高[15-16]。生精小管的萎縮和塌陷、生殖細(xì)胞數(shù)量的減少和上皮細(xì)胞高度的降低是銅暴露小鼠睪丸中典型的組織病理學(xué)損傷[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,親代銅暴露下,子代大鼠睪丸的生精小管中生精細(xì)胞疏散,各級(jí)精原細(xì)胞排列紊亂且形態(tài)異常;精子數(shù)量減少,活力下降,畸形率上升,而且銅處理劑量越大,超過機(jī)體自身耐受劑量,損傷和病理改變程度就越明顯,睪丸中銅沉積也越多。研究結(jié)果說明了高濃度銅引起的睪丸損傷、精子數(shù)量及活力降低,其機(jī)制可能是高銅激活了線粒體凋亡的信號(hào)通路,降低精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的數(shù)量并影響精子發(fā)育,引起睪丸發(fā)生表觀遺傳修飾,最終損傷雄性生殖[18]。綜上所述,親代飼喂高銅日糧,會(huì)引起子代大鼠發(fā)生氧化應(yīng)激,影響精子生成及睪丸功能。