王新磊， 宋學博， 朱 琳， 鄭福平，*， 孫寶國，李澤霞， 張煜行

(1.北京工商大學 食品質量與安全北京實驗室/中國輕工業(yè)釀酒分子工程重點實驗室， 北京 100048；2.河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司， 河北 衡水 053000)

白酒是中國傳統的蒸餾酒，歷經2000多年的傳承與發(fā)展，形成了自己獨特的風格特征，與白蘭地、威士忌、伏特加、朗姆酒及金酒齊稱為世界六大蒸餾酒[1]。中國白酒以一種或多種谷物(高粱、大米、小米、玉米、小麥、豌豆等)為原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑(酒曲)，經固態(tài)法釀造、固態(tài)甑桶蒸餾、陶壇貯存等傳統工藝釀制而成[2-4]。白酒釀造所用酒曲為自然接種，不僅為發(fā)酵過程提供多種微生物，還對白酒的風味具有重要的貢獻，同時，固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾的獨特工藝更使得中國白酒風格特征明顯不同于世界其他蒸餾酒。

中國白酒按香型可以分為清香型、濃香型、醬香型、老白干香型、米香型、芝麻香型、特香型、鳳香型、藥香型、豉香型、兼香型、馥郁香型十二大香型[5]，老白干香型白酒以衡水老白干為代表，以高粱為原料，純小麥制中溫大曲為糖化發(fā)酵劑，采用混蒸混燒老五甑(簡稱“老五甑”)和清蒸清燒三排凈(簡稱“三排凈”)兩種工藝，經地缸發(fā)酵、固態(tài)蒸餾而得[6]。老五甑工藝特點是原料與酒醅按一定比例混勻后進行蒸餾，即蒸酒蒸料同時進行[3]，每輪次發(fā)酵都含有一定比例上輪次酒糟，而三排凈工藝則是原料與酒醅分別蒸餾，即先蒸料后蒸酒[1]，新糧發(fā)酵三輪次后直接丟糟，這也是兩種工藝的主要區(qū)別[7]，兩種工藝的工藝流程見圖1。老白干白酒香味特征主要是以乳酸乙酯和乙酸乙酯為主體香，其中乳酸乙酯與乙酸乙酯含量比不小于0.8，具有“高而不烈、低而不淡，醇厚甘洌，回味悠長”的風格特點。

圖1 老白干原酒生產工藝流程Fig.1 Production process of base Laogbaigan Baijiu

目前對老白干白酒發(fā)酵過程中風味物質的研究主要集中在酒醅中主要風味物質的變化規(guī)律。黃建華等[6]分別對4月和5月入池發(fā)酵酒醅進行動態(tài)監(jiān)控，發(fā)現5月入池的酒醅酒精生成速度明顯高于4月份，且發(fā)酵2 d、4 d和8 d是發(fā)酵的關鍵時期。朱會霞等[8]對不同季節(jié)老白干酒三排凈工藝大茬酒醅中乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙醇、乙醛、正丙醇、異丁醇及異戊醇在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律進行了研究，發(fā)現除乙醛外，其余6種風味物質隨季節(jié)變化趨勢明顯。但是，對于老白干白酒全年生產原酒中主要風味成分含量的差異及變化規(guī)律還未見報道。本研究通過對河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司2016年1月至12月生產的不同工藝、不同種類的老白干香型白酒原酒中主要風味成分的含量差異及變化規(guī)律進行系統分析，希望為老白干香型白酒工藝改進及產品質量提升提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：收集河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司釀酒車間2016年1月至12月生產的不同種類原酒2 573批次，樣品信息見表1。

表1 老白干原酒樣品信息Tab.1 Sample information of base Laobaigan Baijiu

實驗試劑：酚酞、NaOH、硫酸，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、乙醛、乙酸乙酯、乙縮醛、甲醇、丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、乙酸異戊酯、乙酸正戊酯，均為色譜純，北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GC- 2010型氣相色譜儀[配備FID檢測器、LZP- 930毛細管色譜柱(白酒分析專用柱18 m×0.53 mm×0.3 μm)和AOC- 20I進樣器]，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1總酸和總酯的測定

樣品中總酸、總酯含量參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》采用酸堿滴定法測定。

1.3.2主要揮發(fā)性成分的測定

老白干老五甑、三排凈原酒的主要風味物質含量參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》進行檢測。選擇乙醛、乙酸乙酯、乙縮醛、甲醇、丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸等13種化合物進行監(jiān)測。

氣相色譜測定條件：參考霍麗娜等[9]方法，以高純氮氣(99.999%)為載氣，流速0.5 mL/min，分流比10∶1，尾吹20 mL/min；氫氣流速40 mL/min；空氣流速400 mL/min；進樣器溫度220 ℃；檢測器溫度220 ℃；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持3 min，3.5 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。以乙酸異戊酯、乙酸正戊酯為內標化合物進行定量檢測。

圖2 老白干三排凈原酒和老五甑原酒樣品的PLS-DA分析Fig.2 PLS-DA analysis of base Laobaigan Baijiu of Sanpaijing and Laowuzeng

1.4 數據統計方法

對收集的2 573個樣品中13種主要風味物質、總酸、總酯含量進行分析。采用SPSS 23.0統計分析軟件對樣本均值、標準差及顯著性進行分析，采用Prism 6和Origin 2018對分析數據進行繪圖。

采用Simca 13.0進行偏最小二乘判別分析(partial least square discriminant analysis，PLS-DA)，對兩種工藝原酒中主要揮發(fā)性成分及總酸、總酯的含量差異進行分析。首先將所有數據取對數，然后進行PLS-DA分析，建立模型并確定兩種工藝主要差異物。通過k-fold交叉驗證(k=7)進行模型驗證，所有樣本6/7的數據用于建立模型，對剩余1/7數據進行預測，并且這個過程進行多次重復，觀察模型變量解釋度R2以及預測度Q2值，以評價模型的有效性和可靠性。通過置換檢驗對模型預測能力進行統計檢驗，評估模型是否過擬合，驗證其合理性和可靠性。根據變量投影重要性值(variable importance in projection, VIP)判斷兩種工藝原酒中主要差異化合物[10]。

采用在線軟件Omic Share(https:∥www.omicshare.com/tools/)進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 三排凈原酒和老五甑原酒樣本的PLS-DA分析

2.2 三排凈原酒和老五甑原酒中主要差異化合物

根據變量投影重要性值(VIP>1)，6種風味化合物被定為差異化合物，分別為乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、異戊醇和正丙醇，見圖3。

圖3 老白干三排凈原酒和老五甑原酒主要差異物分析Fig.3 Different compounds of base Laobaigan Baijiu of Sanpaijing and Laowuzeng

由圖3可知，乳酸乙酯的VIP值最高，為1.70；其余風味物質VIP值在1.06～1.47。進一步對這些差異化合物在兩種工藝原酒中的含量差異進行比較，以化合物的質量濃度(mg·L-1)的自然對數為縱軸作圖，見圖4。由圖4可知，老白干三排凈原酒中乳酸乙酯和正丙醇含量明顯高于老五甑原酒，而乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和異戊醇含量則明顯低于老五甑原酒。

對比三排凈工藝和老五甑工藝，二者主要差異在于入缸發(fā)酵底醅和裝甑蒸餾酒醅的組成不同，老五甑工藝入缸發(fā)酵底醅和裝甑蒸餾酒醅都是一定比例原料和酒醅的混合物，而三排凈工藝則是純原料或純酒醅。二者工藝上的差別使得底醅在入缸發(fā)酵時理化性質(如淀粉含量、蛋白含量、pH值等)存在較大的區(qū)別，進而影響發(fā)酵過程中微生物菌群的生長和代謝，使得發(fā)酵產物濃度存在較大區(qū)別。主要風味成分含量的差異，也使得這兩種工藝生產的原酒香氣和口感特點存在較大差異。三排凈工藝原酒清正純凈的特點更明顯，而老五甑工藝原酒酒體則更豐滿醇厚。因此，在酒體設計時可將二者結合搭配使用，起到揚長避短的作用。

圖4 老白干三排凈原酒和老五甑原酒中主要差異物含量對比Fig.4 Comparison of contents of main different compounds in base Laobaigan Baijiu of Sanpaijing and Laowuzeng

*表示數據間差異顯著(P<0.0001)。圖5 老白干三排凈和老五甑不同種類原酒中乳酸乙酯和乙酸乙酯含量差異分析Fig.5 Analysis on difference of contents of ethyl lactate and ethyl acetate in different kinds of base Laobaigan Baijiu of Sanpaijing and Laowuzeng

老白干香型白酒中，乙酸乙酯和乳酸乙酯是兩種主要的酯類化合物，其含量及相對比例對老白干香型白酒的風格特征具有重要影響[8]，只有二者的含量在合理范圍內且比例適當(乳酸乙酯/乙酸乙酯≥0.8)時，才能形成典型的老白干香型風格，這也是老白干香型白酒雖風格與清香型白酒十分相似，但又不同于清香型白酒的主要原因。因此，本研究進一步分析了三排凈工藝和老五甑工藝不同種類原酒中乳酸乙酯和乙酸乙酯含量的差別，結果見圖5。由圖5可知，同一工藝不同種類原酒中乳酸乙酯和乙酸乙酯含量均存在顯著性差異(P<0.0001)，其中壓排酒中含量最高，這是由于壓排酒發(fā)酵期由28 d延長至58 d，有利于乳酸乙酯和乙酸乙酯的生成，這也是壓排酒酒體醇厚豐滿的重要原因之一。中段酒中，乙酸乙酯含量較高，乳酸乙酯含量較低，這是由于乳酸乙酯沸點較高，大多在蒸餾后段才能餾出，而中段酒僅摘取蒸餾中間時段的餾分，所以其乳酸乙酯含量低，而乙酸乙酯沸點較乳酸乙酯低，因此其在中段酒中含量較乳酸乙酯高。豐富的乙酸乙酯可賦予中段酒清新的果香[12]，在酒體設計時可用作調味酒，增加產品的酯香和果香特點。

2.3 生產月份對原酒中主要風味物質含量的影響

2.3.1對酯類化合物的影響

由于1～3月份主要生產中段酒，8月份為壓排酒，與普通酒沒有可比性，所以本研究分別選取了2016年4月、5月、6月、7月、9月、10月、11月、12月生產的老五甑普通酒原酒和三排凈普通酒原酒為對象，對乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯含量變化規(guī)律進行分析，結果見圖6。

圖6 不同月份生產的老白干三排凈工藝和老五甑工藝原酒中酯類物質含量變化趨勢Fig.6 Change trend of esters contents in base Laobaigan Baijiu of Sanpaijing and Laowuzeng produced in different months

由圖6可知，從4月至12月，三排凈普通酒原酒中，乳酸乙酯和乙酸乙酯含量呈現先增加后降低的趨勢，乳酸乙酯含量變化幅度較乙酸乙酯的變化幅度更大一些，在6～7月份含量最高；而乙酸乙酯含量變化則較平穩(wěn)。乳酸乙酯和乙酸乙酯含量先增加后降低的變化趨勢與老白干白酒主要產地(河北衡水)同期環(huán)境溫度變化趨勢相一致。因此推測，隨著環(huán)境溫度上升，釀酒微生物代謝活力增強，與乳酸乙酯和乙酸乙酯相關的乳酸菌和生香酵母活性[13]也同樣增強，酒醅中生成乳酸乙酯和乙酸乙酯的前體物質(乳酸、乙酸、乙醇)增多[14]，因此乳酸乙酯和乙酸乙酯的含量也隨之增加；另一方面，由于乳酸比乙酸更加傾向于溫度較高的環(huán)境，所以乳酸乙酯的變化幅度較乙酸乙酯大[15]。己酸乙酯和丁酸乙酯含量全年基本沒有變化，維持在較低的水平，其中丁酸乙酯含量略低于己酸乙酯。老白干香型白酒對己酸乙酯含量要求是小于等于0.03 g/L，這是老白干香型白酒與濃香型白酒最大的區(qū)別。其主要原因是由于二者的發(fā)酵設備不同，老白干香型白酒采用地缸發(fā)酵，酒醅與泥土隔絕，而濃香型白酒采用泥窖發(fā)酵，與己酸乙酯生成相關的己酸菌和甲烷菌主要在窖泥中富集[16]，因而己酸乙酯是濃香型白酒中的主要酯，而在老白干香型白酒中含量較低。

老五甑普通酒原酒中，上述四種酯類含量的變化規(guī)律與三排凈普通酒原酒變化規(guī)律稍有不同。老五甑普通酒原酒中，乙酸乙酯呈逐漸增加的趨勢，乳酸乙酯含量則較平穩(wěn)，二者在9月份均出現較明顯的降低。推測原因是9月生產原酒是8月壓排轉排后發(fā)酵生產，混蒸混燒工藝保留了大部分壓排酒醅，前一輪發(fā)酵對本輪發(fā)酵產生較大影響，進而影響了微生物代謝產物的積累。己酸乙酯呈先降低后升高的趨勢，9月份含量最低。而丁酸乙酯含量變化不大，均處于較低水平，這與上述三排凈工藝的規(guī)律類似。

2.3.2對乙醛和乙縮醛的影響

適量的乙醛和乙縮醛對白酒的香和味起著重要的協調和平衡作用[17]。它們在酒中含量多少及相對比例，一定程度上影響著白酒的風格特點及飲用舒適度。本研究考察了乙醛和乙縮醛在不同月份生產的原酒中的變化情況，結果見圖7。

圖7 不同月份生產的老白干三排凈工藝和老五甑工藝原酒中乙醛和乙縮醛含量變化趨勢Fig.7 Change trend of acetaldehyde and acetal contents in base Laobaigan Baijiu of Sanpaijing and Laowuzeng produced in different months

由圖7(a)可以看出，4月至12月，三排凈普通酒原酒中乙醛和乙縮醛均呈先增加后降低的趨勢，在9月份達到最高值。乙醛是酒醅發(fā)酵過程中微生物代謝的中間產物[8]，乙醛與乙醇縮合可生成乙縮醛[17]，4月至9月，其含量逐漸增加，表明隨著氣溫逐漸升高，微生物的代謝逐漸活躍，分子間的縮合反應增強，9月至12月，氣溫逐漸降低，微生物的代謝也隨之降低，乙醛和乙縮醛的生成量也隨之減少。

圖7(b)為老五甑普通酒原酒中乙醛和乙縮醛的變化情況。乙醛含量從4月至5月略有上升，之后呈逐漸下降趨勢，12月份有略有上升；而乙縮醛則呈逐漸降低的趨勢。這與三排凈工藝有較大的區(qū)別，推測混蒸混燒的生產工藝酒醅中微生物的生長和代謝不僅受溫度的影響，還受上一輪酒糟理化性質的影響，其發(fā)酵過程較清蒸清燒工藝更復雜，進而影響了酒醅中代謝產物的生成和積累。

2.3.3對醇類化合物的影響

對甲醇、正丙醇、仲丁醇、異丁醇、正丁醇和異戊醇在不同月份生產的三排凈普通酒原酒和老五甑普通酒原酒中平均質量濃度變化規(guī)律進行分析，結果見圖8。

圖8 不同月份生產的老白干三排凈和老五甑普通酒原酒中醇類物質含量變化趨勢Fig.8 Change trend of alcohols contents in base Laobaigan Baijiu of Sanpaijing and Laowuzeng produced in different months

甲醇是國家標準中規(guī)定的一項重要衛(wèi)生指標，要求其在白酒中質量濃度小于等于0.6 g/L。從圖8中可以看出老白干香型白酒原酒中，甲醇含量遠遠低于國家標準規(guī)定，且不同月份生產原酒中含量基本穩(wěn)定，這有利的保障了產品的安全性。三排凈普通酒原酒中正丙醇、異丁醇和異戊醇呈先降低后升高的趨勢，但變化幅度不大，推測隨著氣溫的升高，酒醅中代謝產生這些化合物的微生物活性略有減弱，代謝產物減少，另一方面也可能是由于溫度升高，醇類的酯化或縮合反應增強，使其轉變?yōu)槠渌衔?。同時，還可發(fā)現，三排凈普通酒原酒和老五甑普通酒原酒中仲丁醇和正丁醇(雜醇油成分)含量明顯低于上述3種醇類，含量極微。白酒中雜醇油含量過高，會作用于神經系統，使人飲后易醉，引起頭痛，而適量的雜醇油在白酒中則有一定的呈香呈味作用[17]。圖8所示老白干香型白酒中雜醇油含量較低，這也是老白干香型白酒醉得慢、醒得快、不上頭的主要原因之一。

2.4 主要風味物質之間相關性分析

相關性分析(correlation analysis)是對兩個或多個具備相關性的變量元素進行分析，從而衡量兩個變量因素的相關密切程度。本研究對老五甑普通酒原酒和三排凈普通酒原酒15個主要風味物質指標之間的相關性進行分析，篩選呈強相關性指標(相關系數≥0.6)，結果見表2。

表2 老白干原酒中強相關性風味物質Tab.2 Strongly correlated flavor compounds in base Laobaigan Baijiu

從表2可以看出，在兩種工藝原酒中均呈強相關性的風味物質有乙醛與乙縮醛、乳酸乙酯與總酯，這與發(fā)酵過程中微生物代謝產物之間的相互轉化關系相一致，即乙醛與乙醇縮合形成乙縮醛，醇與酸酯化生成酯[18]。同時，也進一步證實了乳酸乙酯和乙酸乙酯是老白干香型白酒中的主要酯類物質。另外，乙酸乙酯與總酯、乙酸乙酯與總酸、總酸與總酯以及異丁醇和丁酸乙酯僅在老五甑普通酒原酒中存在強相關性，而正丙醇與仲丁醇、異丁醇與異戊醇僅在三排凈普通酒原酒中呈強相關性。其中，值得注意的是正丙醇與仲丁醇、異丁醇與異戊醇在三排凈工藝原酒中呈強相關性，而在老五甑工藝原酒中二者相關性卻不明顯。分析三排凈和老五甑兩種工藝，區(qū)別主要體現在老五甑工藝發(fā)酵底醅中新加入原糧的比例較大，這就造成兩種工藝底醅中蛋白質及氨基酸類物質含量和種類產生較大的差異，而白酒中雜醇油產生的一個主要途徑為氨基酸的降解[19]，這就可能會造成兩種工藝生產的原酒中正丙醇與仲丁醇、異丁醇與異戊醇表現出不同的相關性。下一步還需進一步研究產生這種差異的具體原因，為進一步優(yōu)化生產工藝、控制產品質量提供數據支撐。

3 結 論

采用統計學方法對2016年1～12月生產的2 573批次老白干香型白酒不同工藝、不同種類原酒中的主要風味物質變化規(guī)律進行分析，發(fā)現三排凈工藝原酒和老五甑工藝原酒差異化合物主要為乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、異戊醇和正丙醇。其中，乳酸乙酯和正丙醇在三排凈原酒中含量明顯高于老五甑原酒，其余則低于老五甑原酒。同一工藝不同種類原酒中，乳酸乙酯和乙酸乙酯含量也存在明顯差異。從4～12月，三排凈普通酒原酒和老五甑普通酒原酒中主要酯類和醛類含量呈先升高后降低的趨勢，而醇類物質含量變化規(guī)律不明顯。相關性分析表明乙醛與乙縮醛、乳酸乙酯與總酯在兩種工藝普通酒原酒中均呈現強相關性。希望本結果可為對老白干香型白酒原酒生產過程中質量控制及工藝優(yōu)化指明方向，也為生產企業(yè)優(yōu)化酒體設計方案、提升產品質量提供理論支撐。