黃瑜，楊帆，李江華*，楊玉波，堵國成，王莉，劉延峰

1(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷，564501) 3(江南大學，未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)4(貴州茅臺酒廠(集團)有限責任公司，貴州 仁懷，564501)

中國白酒是世界上著名蒸餾酒之一，具有千年歷史。白酒的生產過程是在一個開放和不受控制的環(huán)境中，來自大曲、高粱、空氣、土壤和未消毒的生產工具中的微生物可能為白酒的生產提供豐富的微生物來源。其中，大曲是一個非常重要的角色。醬香型高溫大曲是以小麥為主要原料、高溫發(fā)酵而成，是白酒釀造所需的糖化發(fā)酵劑和生香劑，提供功能微生物及其代謝物，有助于風味物質的產生，形成獨特的醬香型白酒風味[1-4]。

近年來多項研究利用高通量測序對大曲的微生物群落進行了廣泛的研究[5-6]。JIN等[6]研究醬香型大曲微生物群落，表明芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Thermoactinomyces、Saccharomyces、Aspergillus和Thermomyces在大曲中是優(yōu)勢微生物。大曲中微生物的相互作用產生了具有多種香氣成分和復雜風味的白酒。地衣芽孢桿菌是優(yōu)勢菌群之一，高產吡嗪類、揮發(fā)性酸類、芳香族和酚類等化合物，增強醬香風味[7]。Bacillusvelezensis和Bacillussubtilis進行生物強化改善大曲風味，增加酯類、吡嗪類和醇類等揮發(fā)性化合物的含量[8]。大曲的生產是在開放且復雜的工作環(huán)境中進行，DU等[9]對大曲微生物來源進行了分析，大曲的細菌群落主要來源于小麥原料，而真菌群落大多來自制作環(huán)境。由此可見，小麥對大曲微生物組成和白酒獨特風味的形成有著重要的影響。然而，基于這方面的研究卻很少。之前的研究集中于小麥原料的質量上[10]，而忽略了小麥原料微生物對大曲微生物區(qū)系的影響。許多微生物會棲息在原輔料表面，與原輔料一起進入到發(fā)酵體系中。例如，在葡萄酒發(fā)酵中，葡萄皮表面的微生物可以在發(fā)酵中生長和存活，參與葡萄酒發(fā)酵并增強葡萄酒的感官復雜性[11-12]。同樣地，由于地理因素和環(huán)境生長條件的差異，形成了獨特的小麥原料微生物區(qū)系。這些微生物為大曲微生物群落的演化帶來更多的可能性，進而影響功能微生物的代謝，影響白酒的品質和風味。

本次研究采用了高通量測序技術，揭示了來自中國5個省份不同產地的21個小麥樣品的微生物群落結構。模擬固態(tài)發(fā)酵制備大曲，采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)結合GC-MS分析模擬大曲的風味物質。這項研究有助于闡明小麥原料微生物對大曲風味物質的影響，為制曲原料的選擇提供參考依據(jù)，對保持大曲風味組成的一致性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

21個小麥樣品分別來自貴州，安徽、四川、湖北和河南5個省區(qū)不同產地，高溫大曲產自茅臺鎮(zhèn)(貴州省，中國)，所有樣品于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒,德國QIAGEN公司；2×TaqPCR Master Mix,寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司。

1.3 儀器與設備

Nano-Drop2000 微量核酸測定儀,無錫萊弗思生物實驗器材有限公司；可伸縮的試驗箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；C1000 PCR儀，賽默飛世爾有限公司；Leco Pegasus GC-HRT 4D 氣相色譜-質譜儀,美國力可公司；7890B 氣質色譜儀、TR-FFAP毛細管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品微生物總DNA的提取

取200 mg樣品加入適量液氮研磨后使用DNeasy PowerSoil Kit試劑盒提取樣品總DNA，步驟參考說明書;使用Nano-Drop2000微量核酸測定儀檢測DNA的含量，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA的完整性。

1.4.2 PCR擴增及測序

細菌16S rDNA全長擴增引物為27F(5′-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-RGYTACCTTGTTACGACTT-3′)；真菌ITS區(qū)擴增引物為ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR擴增反應體系(50 μL)：1 μL模板DNA，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，22 μL 無菌雙蒸水。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min[13]。擴增序列由武漢華大基因科技有限公司進行測序。16S rDNA序列使用Pacbio測序平臺，ITS擴增序列使用Hiseq2500測序平臺。

1.4.3 高通量測序數(shù)據(jù)分析

對原始數(shù)據(jù)進行過濾、去除接頭以及低質量序列。使用FLASH軟件(v1.2.11)[14]，利用重疊關系將雙末端測序列連接配對，獲得高質量標簽。利用UPARSE軟件(v7.0.1090)[15]在97%相似度下進行聚類得到可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，并用UCHIME軟件(v4.2.40)[16]去除嵌合體得到OTU代表序列。利用RDP classife軟件(v2.2)[16]將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋。細菌OTU使用Greengenes(v201305)數(shù)據(jù)庫、真菌OTU使用UNITE(v201407.03)數(shù)據(jù)庫比對。

Alpha多樣性使用MOTHUE軟件(v1.31.2)計算[17]，Beta多樣性和樣品聚類分析使用QIIME軟件(v1.8.0)計算[18]。聚類樹和物種豐度柱狀圖使用phytools和R語言(v3.5.1)繪制。

1.4.4 固態(tài)發(fā)酵實驗

取750 g小麥原料，加入52.5 g母曲和285 mL無菌水混合均勻后，捏制成型。放入可伸縮的試驗箱， 在30 ℃下發(fā)酵30 d。以高溫大曲生產工藝為基礎進行固態(tài)發(fā)酵[19]。

1.4.5 大曲揮發(fā)性成分的測定

取2 g粉碎大曲樣品放入15 mL頂空瓶中，在50 ℃自動SPME裝置中平衡5 min，以500 r/min萃取30 min后進入GC-MS系統(tǒng)。氣相色譜條件：TR-FFAP毛細管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；氦氣流速1 mL/min；升溫程序：初始溫度45 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升溫速率升溫至230 ℃，保持6 min。質譜條件：電子轟擊電離；電子能量為70 eV；四級桿溫度為150 ℃，離子源溫度為230 ℃，采集模式為全掃描，掃描范圍35～550m/z[20]。

2 結果與分析

2.1 小麥樣品微生物多樣性分析

采用高通量測序技術，分析21個小麥樣品的微生物組成。樣品詳細信息見表1。

細菌16S rDNA全長測序，共獲得171 147個高質量序列，并按97%的相似度聚類得到23 572個OTU。對于真菌，共獲得1 002 154個高質量序列，共聚類得到1 492個OTU。Shannon指數(shù)稀釋曲線分析表明小麥樣品細菌16S rDNA和真菌ITS測序到達平臺期，說明本次測序水平下覆蓋了樣品中絕大多數(shù)的微生物群落信息，充分的展現(xiàn)群落多樣性(圖1)。

表1 小麥樣品信息Table 1 Wheat sample information

本研究通過Shannon指數(shù)和物種數(shù)目(observed species)對樣品微生物的Alpha多樣性進行表征。Alpha多樣性結果顯示了不同產地小麥樣品多樣性的差異。對于細菌群落，湖北省小麥樣品的群落豐富度(species richness)和多樣性(species diversity)均高于其他4個省份，四川省小麥樣品Alpha多樣性最低(圖2-a)。對于真菌群落，四川省小麥樣品的群落豐富度和多樣性均高于其他4個省份，河南省小麥樣品的Alpha多樣性最低(圖2-b)。

Beta多樣性由主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)表征，顯示不同產地小麥樣品OTU存在差異。對于細菌群落，PC1解釋了總變異的41.75%，PC2解釋了總變異的22.83%(圖2-c)，表明同一省份不同產地小麥樣品的細菌群落相似性很低。對于真菌群落，PC1解釋了總變異的41.9%，PC2解釋了總變異的30.05%，揭示了小麥樣品真菌群落相似性較高(圖2-d)。

a-細菌測序稀釋曲線；b-真菌測序稀釋曲線圖1 小麥樣品中細菌和真菌測序稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacterial and fungal community of wheat samples

a-細菌Alpha多樣性分析；b-真菌Alpha多樣性分析；c-細菌PCoA分析；d-真菌PCoA分析圖2 小麥樣品細菌和真菌多樣性分析Fig.2 Alpha diversity estimates of bacterial and fungal communities

PCoA分析揭示了不同產地小麥樣品的細菌群落結構有較大差異，而真菌群落結構則差異相對較小。小麥原料微生物包括細菌和真菌微生物[21]。小麥細菌微生物大部分寄附在種子表面，內生細菌在植物體內生物量相對較少[22-23]。小麥表面細菌受生長環(huán)境中緯度、溫度、濕度等自然條件的影響[21,24],因此，不同產區(qū)小麥樣品由于生長環(huán)境不同，細菌微生物組成有所差異。小麥真菌微生物主要受田間和貯藏環(huán)境的影響[21,24]，在貯存期間，貯藏真菌逐漸代替田間真菌，不同貯藏環(huán)境下，優(yōu)勢真菌差異較小[25]。小麥內生真菌在田間生長期和貯存期間優(yōu)勢真菌沒有明顯差異，種子內部的真菌物種差異不明顯[26-28]，因此不同產地小麥真菌微生物群落結構差異相對較小，本文分析結果與此前報道結果相符。此外，細菌是大曲風味物質的主要貢獻者。因此，根據(jù)細菌微生物群落的相似性，我們將21個小麥樣品分為4組，具體樣品信息見表2。

表2 重分組樣品信息Table 2 Regroup wheat sample information

2.2 小麥樣品細菌群落組成差異分析

21個小麥樣品檢測出的細菌門主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍藻門(Cyanobacteria)。屬水平共檢測出466個屬。不同產地的小麥樣品中細菌群落組成存在差異(圖3-a)。A組樣品中泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及Massilia是相對豐度較高的細菌屬。樣品BDM以泛菌屬(57.28%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(5.72%)和假單胞菌屬(4.01%)為優(yōu)勢細菌屬。B組樣品中泛菌屬是主要的細菌屬。短桿菌屬(Curtobacterium)(38.98%)、假單胞菌屬(2.28%)和鞘氨醇單胞菌屬(0.80%)在樣品FYM.1中占主導地位。與A、B兩組樣品不同，Massilia在C組樣品中占優(yōu)勢地位。樣品YJM.1中Massilia相對豐度最高(10.88%)，其次為Frigoribacterium(2.93%)和鞘氨醇單胞菌(0.85%)。與C組樣品相似，Massilia也是D組樣品中最豐富的細菌屬。樣品PTM中Massiilia、假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬占比較高，分別為20.28%、20.08%和6.88%。

種水平上共檢測出917個細菌種群。如圖3-b所示，Pantoeaagglomerans在A組樣品中占絕對優(yōu)勢。樣品BDM的優(yōu)勢細菌種群為P.agglomerans(54.16%)、Pseudomonasbrenneri(3.16%)和Curtobacteriumflaccumfaciens(1.17%)。B組樣品中，樣品FYM.1中Curtobacteriumcitreum相對豐度最高(33.12%)，其次為C.flaccumfaciens(4.5%)和Sphingomonasaerolata(0.48%)。C組樣品中Massiiliaaurea是主要的細菌種群。樣品YJM.1中M.aurea、Frigoribacteriumfaeni和Massiliabrevitalea占主要地位，相對豐度分別為6.30%，1.51%和1.39%。D組樣品，除樣品PTM和XYM.1外，M.aurea是其他樣品中最豐富的細菌種群。樣品PTM中Sphingomonasfaeni(17.28%)為優(yōu)勢細菌，樣品XYM.1中C.flaccumfaciens(5.81%)相對豐度較高?？傮w而言，P.agglomerans和M.aurea是小麥樣品主要的細菌種群。

a-屬水平細菌群落結構；b-種水平細菌群落結構圖3 小麥樣品細菌微生物群落結構(相對豐度>0.5%)Fig.3 Composition of dominant bacterial genera/ species of wheat samples (relative abundance>0.05%)

2.3 小麥樣品真菌群落組成差異分析

真菌門主要包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota)。21個樣品共檢測出200個屬，其微生物群落組成差異較小。如圖4-a所示，A組樣品中鏈格孢屬(Alternaria)、附球菌屬(Epicoccum)和枝孢屬(Cladosporium)是主要的真菌屬。樣品BDM中鏈格孢菌屬相對豐度最高(61.84%)。B組樣品中，附球菌屬是樣品FYM.1(37.67%)和樣品GSM(67.99%)的優(yōu)勢真菌。在C組樣品LHKM.1中，鏈格孢屬(91.38%)是最豐富的真菌屬。對于D組樣品，樣品XYM.1中曲霉屬占比較高(40.00%)，其次是附球菌屬(18.57%)和裸孢殼屬(Emericella)(16.71%)。

種水平共檢測出172個真菌種群。如圖4-b所示，A組樣品以黑附球菌(Epicoccumnigrum)和黃曲霉菌(Aspergilluscibarius)為優(yōu)勢真菌。樣品BDM、M1906和NCM以黃曲霉菌為主要的真菌，相對豐度分別為61.82%、36.11%和29.39%。B組樣品中，Alternariaalternata是樣品FYM.2(58.98%)、HXM.1(84.26%)和THM.2(84.12%)的優(yōu)勢真菌。C組樣品中，Tilletiabromi是樣品XCM的重要真菌種群，但在其他樣品中相對豐度非常低(<0.5%)。D組樣品中，樣品XYM.1中的優(yōu)勢真菌群落為黃曲霉菌(38.95%)，而其他小麥樣品中A.alternata相對豐度較高?？傮w而言，A.alternate和黑附球菌是小麥樣品中的主要真菌群落。

a-屬水平真菌群落結構；b-種水平真菌群落結構圖4 小麥樣品真菌微生物群落結構(相對豐度>0.5%)Fig.4 Composition of dominant fungal genera/species of wheat samples (relative abundance>0.05%)

聚類分析表明，不同產地小麥樣品微生物組成存在差異(圖5)。結果表明，細菌種水平上，樣品BDM與M1906細菌群落結構相似性最高。樣品FYM與XYM.1、YJM.1與XCM、PTM與THM.2的細菌群落組成最為相似，而真菌群落組成有所不同。大曲的細菌主要來源于小麥原料，而真菌則來自大曲的生產環(huán)境和工具?；赑CoA分析(圖2-c)，每組分別選擇一種代表性樣品(A組：BDM；B組：FYM.1；C組：YJM.1；D組：PTM)進行固態(tài)發(fā)酵實驗。為了探究小麥微生物組成與大曲風味物質間的相互關系，使用與代表性樣品細菌群落結構相似性較高的小麥樣品進行模擬制曲，比較其風味物質的差異。

a-細菌屬水平聚類分析；b-真菌屬水平聚類分析圖5 小麥樣品微生物聚類樹與豐度組合圖 (相對豐度>0.5%)Fig.5 Unweighted pair group method with arithmetic mean analysis(relative abundance>0.05%)

2.4 小麥微生物組成與大曲風味物質關系分析

通過HS-SPME-GC-MS測定揮發(fā)性物質。如圖6-a所示，4個代表性樣品(A組：BDM；B組：FYM.1；C組：YJM.1；D組：PTM)共鑒定出212種揮發(fā)性成分，包括醇類(16)、酮類(20)、酯類(19)、吡嗪類(20)、烷烴類(27)、酸類(5)、醛類(5)、芳烴類(10)和其他類(90)。模擬的大曲中醇類和吡嗪類物質是高豐度的揮發(fā)性物質。為了更好地評估模擬大曲的風味，選用11種特征風味物質[29]，比較其在模擬大曲中的差異，計算其相對含量，結果如表3所示。

結果表明，模擬大曲的特征風味物質有所不同。樣品BDM-D中鑒定出5種特征風味物質、YJ-D、PTM-D和FY-D中鑒定出7種(圖6-b)。模擬大曲以四甲基吡嗪為主體風味物質，其中樣品BDM-D和PTM-D中四甲基吡嗪相對含量為突出(>70%)，四甲基吡嗪是醬香香氣的重要風味物質之一。此外，2,3-丁二醇在模擬大曲的相對含量高于其他5種風味物質，模擬大曲中丁酸、苯乙醇和苯甲醛相對含量較低(<1%)。

主成分分析(principal components analysis,PCA)顯示了模擬大曲中風味物質組成的相似性和差異性。如圖7所示，8個大曲樣品形成獨立的5簇。樣品M1906-D與BDM-D距離較近，獨立形成一簇；樣品TH-D與PTM-D遠離其他樣品，單獨形成一簇；樣品FY-D與XY-D、YJ-D與XC-D距離較近，分別形成一簇。樣品M1906-D與BDM-D特征風味物質的種類和相對含量較為相似，以四甲基吡嗪為主(相對含量>70%)。樣品XY-D檢測出7種特征風味物質，種類與樣品FY-D相同，且風味物質的組成較為相近。樣品XC-D與YJ-D風味物質的組成也較為相近，四甲基吡嗪是主要的風味物質，2,3-丁二醇的含量相對較高。同樣地，樣品TH-D和PTM-D的大曲風味物質組成較為相似。微生物區(qū)系聚類中(圖5-a)，BDM與M1906在相同分支，細菌群落結構相似性最高；樣品FYM與XYM.1在相近分支、YJM.1與XCM、PTM與THM.2分支距離較短，細菌微生物群落組成最為相似。PCA分析與微生物區(qū)系聚類分析結果相似，總的來說，小麥樣品細菌群落結構相似性越高，模擬大曲的特征風味物質組成有著更高的相似度。

a-大曲揮發(fā)性物質種類分布；b-大曲中特征風味物質的相對含量圖6 大曲揮發(fā)性物質Fig.6 Bar graph of the concentrations of the volatile compounds in Daqu

表3 大曲中11種特征風味物質的相對含量 單位：%

圖7 大曲風味物質組成PCA分析Fig.7 Principal components analysis of flavor compounds in Daqu samples

3 結論與討論

白酒是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的典型代表，而大曲是白酒釀造過程中微生物富集的重要步驟。本研究中，通過16S rDNA全長測序和ITS rDNA測序分析了來自中國5個省份不同地區(qū)的21個小麥原料的微生物群落。通過固態(tài)發(fā)酵實驗，比較了模擬大曲中揮發(fā)性物質的差異。結果表明，細菌組成中，樣品BDM，F(xiàn)YM.1，YJM.1和PTM分別以P.agglomerans(54.16%)、Curtobacteriumcitreum(33.12%)、M.aurea(6.30%)和S.faeni(17.28%)為主要的細菌。就真菌而言，樣品BDM(61.84%)、YJM.1(69.11%)和PTM(61.41%)以鏈格孢菌屬為主；而FYM.1樣品以附球菌屬(37.67%)為優(yōu)勢真菌。使用不同產地小麥制曲時，大曲的風味物質有所不同，模擬大曲以四甲基吡嗪為主體風味物質。樣品BDM和M905產區(qū)小麥原料制曲時，可能會增強醬香風味，增加吡嗪類物質的含量。此外，選擇樣品PTM和YJM產區(qū)小麥制備大曲，2,3-丁二醇含量可能會有所提高。通過微生物聚類分析和大曲風味物質組成PCA分析，小麥樣品微生物與風味物質組成有密切的相關性，小麥原料微生物相似度較高，大曲風味物質組成更加相似，對了解不同產區(qū)小麥原料生產的大曲風味成分組成具有指導意義。

高溫大曲是由未經滅菌的原料經過固態(tài)發(fā)酵制成的，而小麥是主要原料。這些小麥原料的表面和內部組織是各種微生物的天然棲息地。自然和內在因素都會影響微生物群落的生長和分布，形成獨特的微生物群落。制曲原料會影響大曲的微生物群落結構，進而影響風味微生物的代謝，直接或間接影響白酒品質和風味。本研究有助于闡明制曲原料微生物組成對大曲風味及白酒品質的影響，為制曲原料的選擇提供參考依據(jù)，對保持大曲風味物質的一致性和白酒的感官復雜性具有重要意義。