王雅倩，洪瑩瑩，宋健，詹玉林

（1.上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學 國家海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心，上海 201306；3.上海中醫(yī)藥大學 健康醫(yī)學院，上海 201203；4.上海市第六人民醫(yī)院 骨科，上海 200233）

在骨科疾病中，因創(chuàng)傷、慢性骨髓炎和腫瘤等引起的骨缺損一直是臨床治療的一個難題，目前骨缺損修復(fù)的方法是自體骨移植、同種異體移植和異種異體骨移植［1］，但這種治療方法存在很多的風險.目前，通過可生物降解的生物材料結(jié)合抗炎、抗菌的藥物或生長因子促進成骨細胞的生長，最終達到治愈骨缺損的目的.殼聚糖（chitosan，CS）又稱脫乙酰甲殼素，具有良好的生物相容性、生物可降解性以及抗菌、抗氧化、低毒性等特點［2－3］.透明質(zhì)酸鈉（HA）是一種優(yōu)良的生物相容性高分子，幾乎存在于每一個哺乳動物的組織中［4］，但在作為骨修復(fù)材料時，殼聚糖和透明質(zhì)酸鈉具有機械性強度差的缺點［5］，常將其與其他生物活性材料混合制備成復(fù)合凝膠.氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是一種高度氧化的化學修飾的石墨烯，它的每一層均由羥基和環(huán)氧官能團組成，邊緣由羧基組成，這些含氧官能團使得氧化石墨烯有利于提高水凝膠的機械強度和親水性［6－8］.水凝膠由高分子鏈通過物理、離子或官能團相互作用交聯(lián)而成，形成能夠吸收數(shù)倍水而不會崩解的3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［9－10］，并且可以向不同類型的細胞傳遞物理和化學信號，指導(dǎo)細胞的行為，如細胞粘附、增殖、遷移和分化［11－13］.本實驗中以CS為基底，β-甘油磷酸鈉（β-glycerophosphate，β-GP）為交聯(lián)劑，復(fù)合HA和GO合成三相復(fù)合溫敏性水凝膠，通過對其成膠時間、結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)和生物生理特性的研究，旨在為骨缺損的治療提供一個新的治療方法.

1 實驗材料

殼聚糖（CS，脫乙酰度90%）購于上海生工生物公司；β-甘油磷酸鈉、氧化石墨烯（單層）、透明質(zhì)酸鈉（USP級，分子量403.31）購于上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素－鏈霉素混合溶液購于美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強版）、RIPA裂解液（強）、PMSF（100 mM）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司.

2 實驗方法

2.1 水凝膠的合成

取2 g的CS溶于100 mL濃度為0.1 mol／L的稀鹽酸中，在室溫下持續(xù)攪拌至全部溶解，待用；配制成的質(zhì)量分數(shù)0.25% GO溶液超聲處理30 min.取5 mL CS溶液于燒杯中，并向其中逐滴滴入1 mL GO溶液和1 mL質(zhì)量分數(shù)0.25%HA溶液，充分攪拌10 min使溶液充分混勻，最后向混合溶液中逐滴加入質(zhì)量分數(shù)60%的β-GP，以上全部過程均在冰上進行.對照組為：CS與質(zhì)量分數(shù)0.25%的GO的混合溶液形成的水凝膠攪拌均勻后放入37℃水浴鍋中成膠.

2.2 成膠時間

采用倒置不倒流觀察法［14］，取5 mL所制備的液體狀態(tài)的水凝膠于15 mL試管中，從移入37℃水浴鍋起開始計時，每隔30 s觀察一次，直至出現(xiàn)倒置不倒流現(xiàn)象為止，記下此時所用的時間.

2.3 微觀形態(tài)特征

將凍干后的樣品進行噴金處理，通過掃描電子顯微鏡（ZEISSGeminiSEM 300，德國）觀察其表面形態(tài)、支架結(jié)構(gòu).

2.4 孔隙率

采用液體驅(qū)替法［15］，將質(zhì)量相同的復(fù)合水凝膠放入同等體積V1的乙醇中，在室溫下浸泡24 h，使其內(nèi)部充滿乙醇，24 h后測量含有納米復(fù)合水凝膠的乙醇體積V2，然后把復(fù)合水凝膠從乙醇中移除，最后的乙醇體積V3.

2.5 吸水性

取凍干后的凝膠（n＝3），稱其質(zhì)量，記為Wd，將其浸泡在蒸餾水中24 h，取出，拭去表面多余水分，再稱其質(zhì)量，記為Ww.

2.6 機械強度

利用質(zhì)構(gòu)儀（TA.XT Plus，SMS）檢測復(fù)合水凝膠的機械強度，將復(fù)合水凝膠均勻地切成直徑10 mm、高20 mm 的圓柱體，使用平推接頭以1 mm／s的速度進行施力壓縮水凝膠原始高度的60%，每個樣品3個平行組.

2.7 體外生物降解實驗

體外生物降解實驗根據(jù)先前報道的方法進行［16］，取質(zhì)量相同的水凝膠材料，記為W0，浸入20 mL的PBS（含有10 000 U／L的溶菌酶）中，置于臺式恒溫搖床37℃，150 r／min中搖晃，每組3個平行樣，每3天更換一次PBS，在第0、7、14、21、28天取出放進烘干機中烘干，稱其質(zhì)量，記為Wi.

2.8 蛋白質(zhì)吸附能力

定量分析吸附在復(fù)合水凝膠材料表面的蛋白質(zhì)分子量，間接證明水凝膠材料的成骨能力.將水凝膠切至均勻大小，先在無水乙醇中水化1 h，然后在PBS中浸泡30 min，后在FBS中37℃孵育1 h，孵育結(jié)束后，將水凝膠表面的FBS吸干，再使用PBS洗滌3次，去除凝膠表面的未結(jié)合和松散結(jié)合的蛋白質(zhì)，沖洗過后在RIPA（含1%PMSF）中孵育1 h洗脫蛋白，洗脫下的蛋白使用BCA蛋白濃度測試試劑盒檢測其吸附蛋白含量.

2.9 體外生物學研究

2.9.1 細胞培養(yǎng)

選用人骨肉瘤細胞MG-63（購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所）評價復(fù)合水凝膠生物學特性，細胞培養(yǎng)在含有質(zhì)量分數(shù)1%青霉素－鏈霉素和10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，每2天更換一次培養(yǎng)基.

2.9.2 材料浸提液的制備

將復(fù)合水凝膠放在體積分數(shù)75%的乙醇中浸泡2 h，使用無菌的PBS清洗干凈，在紫外燈下照射2 h進行滅菌處理，依照ISO10993－12：2012的樣品制備原則［17］，將滅菌后的復(fù)合水凝膠按照0.1 g／mL向離心管中加入DMEM培養(yǎng)基（含有質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清和1%雙抗），放在37℃、相對濕度100%、體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，取出放在4℃冰箱備用.

2.9.3 細胞毒性評估

Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測細胞毒性試驗，向96孔中加入細胞密度為1×104／孔的細胞懸液，培養(yǎng)24 h使細胞貼壁，然后將細胞培養(yǎng)基更換為細胞浸提液，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和48 h時，每孔加入10μL CCK-8的溶液，避光培養(yǎng)2 h，后用酶標儀測其在波長450 nm下的吸光度值.

2.9.4 細胞形態(tài)

向6孔板中加入8×104／孔MG-63細胞，并向其中加入2 mL的水凝膠浸提液（含有質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清和1%雙抗），DMEM作為空白組，在37℃、100%相對濕度、體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，吸去孔板中浸提液，使用PBS清洗后，在倒置顯微鏡下拍攝細胞形態(tài).

2.10 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8和Origin 9統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以均數(shù)（ˉx）±標準差（SD）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義.

3 結(jié)果

3.1 水凝膠的合成及其成膠時間

復(fù)合水凝膠成膠之前呈現(xiàn)水狀（圖1A），在37℃成膠后出現(xiàn)“果凍狀”（圖1B）.CS／GO的平均成膠時間為（42.50±0.83）min，而復(fù)合水凝膠CS／GO／HA的平均時間為（16.83±0.44）min，加入HA的水凝膠的成膠時間明顯降低，且兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）.

圖1 復(fù)合水凝膠的形成過程Fig.1 The formation process of composite hydrogel

圖2 復(fù)合水凝膠的成膠時間Fig.2 Gel time of composite hydrogel

3.2 復(fù)合支架表征

掃描電鏡通過對凍干后的復(fù)合水凝膠進行表征觀察，SEM結(jié)果（200×）呈現(xiàn)孔隙大小均勻的“蜂窩狀”結(jié)構(gòu)（圖3A），在放大后（500×）可以看出孔隙之間相連接（圖3B），孔隙間的連通性為細胞生長提供了良好的環(huán)境，這有利于細胞的遷移和營養(yǎng)物質(zhì)的流動，也影響細胞的粘附和生存能力.

圖3 CS／GO／HA的掃描電鏡圖Fig.3 SEM of CS／GO／HA

3.3 孔隙率、吸水性和機械強度

納米復(fù)合材料的孔隙率在新骨形成中起著至關(guān)重要的作用，它優(yōu)化了營養(yǎng)物質(zhì)的運輸、蛋白質(zhì)的傳遞、促進細胞的遷移和擴張［18］，如表1所示，CS／GO／HA的孔隙率是（71.90±4.56）%，CS／GO的孔隙率是（58.93±3.09）%，加入HA的納米水凝膠孔隙率有所增加（P＜0.05）；納米復(fù)合材料的吸水性對體液的吸收、細胞的滲透以及營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的利用都是必不可少的，CS／GO的吸水率是（138.77±29.89）%，而CS／GO／HA的吸水率達到（229.63±6.41）%，加入HA的水凝膠的吸水率明顯增加（P＜0.05）；復(fù)合水凝膠的機械性能，在骨組織再生過程中保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有很重要的意義，CS／GO的機械性能（931.80±63.27）kPa，CS／GO／HA的機械性能（1 399.36±33.65）kPa，這可能是由于HA的親水性，減少了水凝膠的收縮，故而增加了其機械強度（P＜0.05）.

表1 水凝膠的孔隙率、吸水率和機械強度Table 1 Porosity and mechanical strength of hydrogels

3.4 蛋白質(zhì)吸附

細胞附著在任何植入的生物材料上都需要一個中間體，而蛋白質(zhì)可以支持細胞－生物材料的相互作用，它強烈影響細胞在生物材料表面的附著和增殖［19］.因此定量估計吸附在納米復(fù)合材料表面的蛋白質(zhì)，以觀察蛋白質(zhì)附著在合成納米復(fù)合材料表面的程度，如圖4所示，加入HA的復(fù)合水凝膠明顯高于CS／GO所吸附蛋白質(zhì)量（P＜0.05），兩者均表現(xiàn)出對蛋白質(zhì)的吸附，但是相比較于CS／GO，CS／GO／HA的蛋白質(zhì)吸附量高達（1.19±0.15）mg／mL，這可能是HA的加入增加了復(fù)合水凝膠表面積的緣故.

圖4 復(fù)合水凝膠上吸附的蛋白量Fig.4 Amount of protein adsorbed on the composite hydrogel

3.5 體外生物降解實驗

生物降解是納米復(fù)合材料在骨組織工程中應(yīng)用的重要參數(shù)，較好的降解率意味著，一旦細胞發(fā)生增殖，以及骨組織的愈合過程完成，納米復(fù)合材料將很快的被清除，CS／GO和CS／GO／HA的體外降解如圖5，隨著孵育時間的增長，復(fù)合水凝膠的降解率是逐漸增高的，從第3周開始，CS／GO／HA的降解率是明顯高于CS／GO的，這可能由于HA的親水性使溶菌酶很容易進入到復(fù)合水凝膠的催化位點，從而加速其降解.在30 d內(nèi)，CS／GO／HA水凝膠的生物降解率達到（90.95±0.35）%，而CS／GO達到（73.77±0.21）%，實驗結(jié)果表明合成的復(fù)合水凝膠CS／GO／HA在一定的時間能夠降解完全.

圖5 復(fù)合水凝膠的降解圖Fig.5 Degradation diagram of the composite hydrogel

3.6 細胞毒性實驗

如果納米復(fù)合水凝膠作為骨移植材料植入的話，納米復(fù)合材料應(yīng)該與哺乳動物細胞具有生物相容性，因此，我們通過CCK-8法研究了合成的納米復(fù)合材料對MG-63細胞的細胞毒性作用.如圖6所示，隨著培養(yǎng)時間的增加，吸光度值隨之增加，表明復(fù)合水凝膠對細胞的增殖無影響，證明具有良好的細胞相容性.MG-63細胞在培養(yǎng)48 h細胞生長狀況如圖7所示，CS／GO組（圖7B）和CS／GO／HA組（圖7C）的細胞形態(tài)和大小與空白組（圖7A）相差無異，呈長梭形，自由舒展，結(jié)構(gòu)完整.

圖6 細胞培養(yǎng)24、48 h的CCK-8結(jié)果Fig.6 CCK-8 results of cells cultured for 24 and 48 h

圖7 MG-63細胞在浸提液中生長48 h的形態(tài)狀況Fig.7 Morphological status of MG-63 cells grown for 48 hours in the extract

3 討論

本研究合成的CS／GO／HA復(fù)合溫敏凝膠相互彌補了原有的缺點，擁有適合細胞生長粘附和增殖的孔隙結(jié)構(gòu)以及支撐細胞生長的機械性，并且研究發(fā)現(xiàn)HA的加入，使得復(fù)合水凝膠擁有更好的親水性和蛋白質(zhì)吸附性，更加有利于水分和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，為細胞提供一個良好的微環(huán)境.

理想的骨組織工程材料除了應(yīng)該具有良好的生物相容性和生物可降解性以外，還應(yīng)具有支撐新生骨組織的機械強度和合適的孔隙率［20－21］.水凝膠是一種親水性均聚物、共聚物且能夠吸收多于自身數(shù)倍的水而不崩解的3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由于它的特殊性質(zhì)使其為細胞的遷移、粘附和增殖分化提供了合適的微環(huán)境［9］.CS是一種天然多糖中唯一的堿性多糖且在酸性的條件下可以形成陽離子聚合物，可以通過共價交聯(lián)和離子鍵結(jié)合高分子化合物來彌補其機械性差、易降解的缺點［22］，對比以往CS水凝膠，本研究通過添加GO和HA提高了水凝膠的機械性能足以支撐骨組織的形成，并且通過CCK-8實驗證明具有良好的生物相容性.

HA是一個天然的陰離子多糖，普遍存在于人體內(nèi)，還是組織細胞外基質(zhì)的主要組成成分，具有良好的生物相容性［23］；GO中含有環(huán)氧官能團和芳香族的sp2結(jié)構(gòu)改善了GO層狀結(jié)構(gòu)的分布，可以促使它與天然聚合物基體的懸掛基團界面結(jié)合［24］.本研究選取GO和HA合成的復(fù)合水凝膠，從SEM可以看出水凝膠的孔隙大小均勻，孔隙之間相互連通為細胞的粘附和增殖提供了充足的空間.相較于CS／GO，添加了HA的復(fù)合水凝膠的孔隙率、吸水性和蛋白吸附量都有一定的增加.在生物降解方面，CS／GO／HA可以在第4周降解完全，這個降解速度在體內(nèi)可能不能滿足骨完全愈合的條件.在以后的實驗中可以通過選擇β-GP與京尼平聯(lián)用的方式增加復(fù)合水凝膠的交聯(lián)度或者添加一些降解速率均勻且降解緩慢的化合物比如聚乳酸－羥基乙酸共聚物或聚乙烯醇等進行改進.對于慢性骨髓炎引起的骨缺損，復(fù)合水凝膠還應(yīng)具備一定的抗菌的能力，而本研究合成的水凝膠的體外成骨能力和抑菌能力還尚不清楚，因此還需進一步實驗驗證.

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CS／GO／HA可以作為一個應(yīng)用于骨缺損的新型水凝膠，具有良好的生物相容性和生物可降解的能力.為了更好地應(yīng)用在骨缺損中，以后的研究可以將此水凝膠作為一個支架，使其負載一些成骨因子、藥物、外泌體和干細胞等，比如：BMP-2、萬古霉素、骨髓間充質(zhì)干細胞等，形成一個持續(xù)緩釋且可以及時降解的復(fù)合體.

作者貢獻聲明

王雅倩：設(shè)計實驗，實驗操作，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；洪瑩瑩：文獻搜索，提出研究框架，修改論文；宋?。簩嶒灁?shù)據(jù)分析；詹玉林：實驗過程監(jiān)督和領(lǐng)導(dǎo)，初稿審核與修改.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.