涂維，劉金坤，沈鴻貴，莫惠婷，蔡紅兵，3*

（1.南方醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 510315；2.重慶市中醫(yī)院 重點實驗室，重慶 400021；3.南方醫(yī)科大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 腫瘤科，廣東廣州 510315）

中藥化香樹果序，已被報道具有多種藥理作用，如抗炎、抗氧化和抗血管生成等［1－3］，民間廣泛用其治療鼻炎及鼻竇炎［4］.課題組前期采用乙醇回流法提取得到化香樹果序醇提物（ethanol extract of infructescence of Platycarya strobilacea，EPS），稱取曬干生藥材4.5 kg，最后得到總提取物180 g，通過高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行分析，已鑒定主要化合物有沒食子酸、槲皮素、鞣花酸、3，3-二甲氧基鞣花酸［5－6］，并證實了EPS作用人鼻咽癌CNE1／2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)形成大量液泡，細(xì)胞代謝活性降低、最終細(xì)胞膜破裂死亡，在這個過程中，沒有觀察到細(xì)胞死亡、染色質(zhì)凝聚或核染色體DNA片段斷裂的過程，而單獨使用沒食子酸、槲皮素、鞣花酸、3，3-二甲氧基鞣花酸處理鼻咽癌細(xì)胞則未觀察到這種現(xiàn)象［7］.這種區(qū)別于自噬、壞死、凋亡的死亡過程［8］，最初由Galluzzi等［9］在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中觀察到，2009年細(xì)胞死亡命名委員會（NCCD）根據(jù)形態(tài)學(xué)分類，將其命名為methuosis死亡［10］.課題組首次將這種死亡方式用中文命名為巨泡式死亡［11］.

目前關(guān)于methuosis死亡的機(jī)制，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為過度活化RAS和RAC誘發(fā)了這種形式的細(xì)胞死亡［12－18］，其他主要研究還集中在溶酶體膜表面標(biāo)志物如Rab5和Rab7和EGFR等方面［19－21］.課題組前期試驗驗證RAS和RAC1的持續(xù)活化誘導(dǎo)了methuosis的發(fā)生，并且使用選擇性RAC1抑制劑EHT1864可逆轉(zhuǎn)EPS誘導(dǎo)的巨泡式死亡現(xiàn)象［7］.后續(xù)通過高通量測序篩選出463個差異基因，通過KEGG Pathway生物通路分析，以及實時定量PCR、蛋白免疫印跡法等實驗驗證，初步證實化香樹果序醇提物可通過調(diào)控RAS／MAPK／FOS信號通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生巨泡式死亡［22］.

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路在控制細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、死亡等多種生理過程中起著極為重要的作用.其基本的信號傳遞遵循MAPKs的三級酶促級聯(lián)反應(yīng)，即上游激活蛋白→MAPK激酶的激酶（MAPKKK）→MAPK激酶（MAPKK）→MAPK.在ERKs的傳遞途徑中Ras作為上游激活蛋白，Raf作為MAPKKK，MAPK／ERK激酶，MEK作為MAPKK，RAS的活化可抑制下游ARF6的活性，即Ras／ARF6／Raf／MEK／ERK途徑［23－24］.ADP核糖基化因子6（ARF6）是RAS家族的成員.其功能主要是調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運和肌動蛋白重塑［25］，在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸和信號傳導(dǎo)過程中具有重要的功能.細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1／2是MAPK家族的成員，能夠被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化而激活，通過進(jìn)入細(xì)胞核作用于c-myc，cfos，c-jun，NF-kB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，和細(xì)胞的增殖與分化密切相關(guān).ERK和其信號途徑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起中介和放大信號的作用，在人類的許多癌癥中都可發(fā)現(xiàn)ERK的過度激活［26］.c-fos基因首次在大鼠成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其編碼的c-fos蛋白是惡性腫瘤生長所必需的即刻早期基因，已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)［27］.景志亮等［28］發(fā)現(xiàn)，與鼻咽上皮組織相比，p-ERK1／2、c-fos在鼻咽癌中表達(dá)明顯上調(diào)，提示其可能發(fā)揮了促癌基因的作用.DUSP1（dual specific phosphase-1）是一種核蛋白，通過去磷酸化使MAPK失活從而對MAPK信號進(jìn)行調(diào)節(jié)，并參與免疫調(diào)節(jié)和化療耐藥［29］，已有研究表明，DUSP1可通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路，參與細(xì)胞增殖、分化、周期阻滯和凋亡［30］.此外，體內(nèi)研究表明，DUSP1通過去磷酸化使ERK、c-jun和p38失活［31］.在一些人類上皮性腫瘤中，包括前列腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌，DUSP1水平升高［32－34］.本課題研究發(fā)現(xiàn)，EPS作用于鼻咽癌細(xì)胞后ARF6、c-fos和DUSP1的表達(dá)與對照組相比有顯著差異.

目前雖然已有化香樹果序作為復(fù)方中藥成分治療急慢性鼻炎、鼻竇炎的相關(guān)研究報道，也有提及化香樹有效成分的提取，以及其提取物的相關(guān)抗菌、抗氧化和抗衰老作用，但未見針對化香樹果序抗癌機(jī)制的報道，在前期試驗基礎(chǔ)上，課題組繼續(xù)深入研究了EPS誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生巨泡式死亡的機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞實驗

1.1.1 藥物配置及細(xì)胞培養(yǎng)

稱取化香樹果序醇提物8 mg，加入1 mL PBS，使其完全溶解后，用7 mL完全培養(yǎng)基稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg／mL的化香樹果序醇提物溶液（根據(jù)前期MTT實驗，同時為方便配置，選取1 mg／mL質(zhì)量濃度進(jìn)行大部分實驗），用0.22μm濾器過濾除菌，保存4℃冰箱備用（化香樹果序醇提物均為現(xiàn)配現(xiàn)用）.c-fos抑制劑T-5224（10 mmol／L，in 1 mL DMSO）購自Apexbio，使用10μmol／L進(jìn)行實驗［35］，DUSP1抑制劑BCI（10 mmol／L，1 mL in DMSO）購自MCE，使用8.0μmol／L進(jìn)行實驗［36］.

人鼻咽癌CNE1／2細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供.細(xì)胞用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃，95%濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后取對數(shù)期細(xì)胞分組進(jìn)行藥物處理.

1.1.2 MTT實驗及平板克隆形成實驗檢測EPS對CNE1／2細(xì)胞的活性及增殖的影響

分別配制6個質(zhì)量濃度梯度的EPS溶液（0、0.25、0.5、1、1.5和2 mg／mL）處理CNE1／2細(xì)胞，24、48 h后依照MTT實驗流程加入MTT、DMSO，酶標(biāo)儀在490 nm波長測定吸光值.在平板克隆實驗中細(xì)胞以每皿100個細(xì)胞接種在60 mm的培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞分散均勻，置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中48 h后，實驗組予1 mg／mL EPS作用細(xì)胞24 h，每日更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)1周后觀察菌落形成情況.染色后，顯微鏡下用肉眼直接計數(shù)有至少50個細(xì)胞的菌落克隆.最后計算克隆形成率，克隆形成率＝克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)×100%.

1.1.3 熒光染色實驗檢測EPS對細(xì)胞攝取胞外物質(zhì)能力的影響

CNE1細(xì)胞分為空白對照組、熒光示蹤劑Lucifer Yellow（LY）處理組、1 mg／mL EPS＋LY處理組、細(xì)胞松弛劑Cytochalasin D＋LY 4組.細(xì)胞與熒光黃溶液（PBS溶解為1.5 mg／mL后使用）在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中共同孵育15 min后倒去培養(yǎng)液，使用PBS清洗3次.立刻用奧林巴斯細(xì)胞顯微鏡進(jìn)行觀察.Cytochalasin D＋LY組在加入熒光黃之前，使用Cytochalasin D（1μmol／L）進(jìn)行預(yù)處理.每組收集105個細(xì)胞，在488 nm激光下激發(fā)流式細(xì)胞儀測定熒光黃的攝取量.在不加熒光黃孵育的對照樣品中，減去自身熒光背景后，得到細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度.

1.1.4 熒光實時定量PCR（Real-time qPCR）檢測差異基因表達(dá)

實時定量PCR法按照SYBR?Premix Ex Taq TM試劑盒說明書來進(jìn)行操作.以GAPDH為內(nèi)參，計算ΔCt值.通過2－ΔCt法確定對照組與實驗組中ARF6、ERKE1／2、c-fos、DUSP1 mRNA表達(dá)的差異.

表1 擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequence

1.1.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測ARF6、c-fos、DUSP1等相關(guān)蛋白差異表達(dá)

兔抗DUSP1和p-dusp1購自abcam公司；兔抗ERK1／2和p-ERK1／2，c-fos，GAPDH，購 自sigma公司；小鼠抗ARF6購自圣克魯斯生物技術(shù)公司.蛋白免疫印跡法按照既往實驗方法及步驟進(jìn)行［7］.

1.1.6 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗分別過表達(dá)c-fos、ARF6及干擾c-fos表達(dá)

按照TIANGEN公司的高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取.按Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染.

1.1.7 免疫熒光觀察c-fos在細(xì)胞的表達(dá)

在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，用4%的多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫通透20min，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；后續(xù)經(jīng)一抗、熒光二抗、復(fù)染核，封片等步驟，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像.

1.2 動物實驗

1.2.1 裸鼠鼻咽癌腫瘤模型的建立與檢測

雌性裸鼠（5周齡，體質(zhì)量15.3～21.3 g）在（23±2）℃、（60±5）%濕度下飼養(yǎng).將指數(shù)期細(xì)胞懸浮于PBS中，107／0.2mL，在裸鼠右側(cè)背部皮下注射0.2 mL細(xì)胞懸液.當(dāng)腫瘤可見時，每天測量腫瘤的長度（L）和寬度（D）.計算腫瘤體積V＝0.5×L×D2，繪制腫瘤生長曲線.將動物隨機(jī)分為3組（n＝6）：①給予0.2 mL PBS處理；②給予0.125 g／（kg·d）EPS治療；③給予0.25 g／（kg·d）EPS治療.采用腹腔注射，成瘤第16天至第30天，每日一次予相應(yīng)劑量處理.第31天，裸鼠被處死，并測量腫瘤體積和腫瘤重量.

1.2.2 免疫組化

用通用型SP試劑盒110 mL（北京中華金橋公司）進(jìn)行免疫染色，結(jié)果在抗原位點有棕色沉淀.染色強(qiáng)度分為0（陰性）、1（弱）、2（中等）或3（強(qiáng)）.陽性細(xì)胞的范圍界定為：0（0～5%）、1（5%～25%）、2（26%～50%）和3（51%～100%）.強(qiáng)度和程度評分的乘積用作c-fos或p-DUSP1的最終染色評分（0～9）.最終染色得分為0到7的腫瘤被認(rèn)為是低表達(dá)，評分為8到12則被認(rèn)為是高表達(dá).

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)分析和作圖均由GraphPad Prism 5.0（數(shù)據(jù)分析和作圖軟件），多組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA方法，各組分別與對照組比較釆用Dunnett檢驗，各組間比較采用Tukey檢驗.過表達(dá)驗證和干擾驗證，若方差齊，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；若方差不齊，采用Welch方法.最終結(jié)果顯示，P＜0.05被視為具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 EPS能抑制CNE1／2細(xì)胞活性及增殖，并誘導(dǎo)其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量液泡形成

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，EPS（1.0 mg／mL）處理CNE1和CNE2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)充滿透明的液泡，48 h后，液泡融合成大相透明液泡，細(xì)胞膜破裂死亡（圖1A），即巨泡式死亡過程.MTT實驗結(jié)果顯示（圖1B、C）在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，EPS對鼻咽癌細(xì)胞活性的抑制作用呈時間、濃度依賴性，且在實驗的6個質(zhì)量濃度梯度中，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg／mL時，其對細(xì)胞的抑制作用最明顯.同時根據(jù)公式lgIC50＝Xm－I［P－（3－Pm－Pn）］／4得出，IC50值為0.49 mg／mL（CNE1，24 h組），0.60 mg／mL（CNE2，24 h組）.平板克隆形成實驗中，CNE1空白對照組細(xì)胞克隆形成數(shù)為（178±13）個，1mg／mL EPS處理組細(xì)胞克隆形成數(shù)為（16±2）個，PSZ組與空白組相比，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；CNE2空白對照組細(xì)胞克隆形成數(shù)為（182±5）個，1 mg／mL EPS處理組細(xì)胞克隆形成數(shù)為（9±3）個，EPS組與空白組相比，P＜0.01.平板克隆形成實驗顯示EPS處理后與空白對照組相比導(dǎo)致了85%至90%的菌落數(shù)減少.說明EPS對鼻咽癌細(xì)胞有長期抑制作用.

圖1 （A）倒置顯微鏡觀察EPS（1 mg／mL）作用后細(xì)胞形態(tài)變化（40×）.（B、C）不同質(zhì)量濃度梯度的EPS對CNE1、CNE2細(xì)胞活力的影響，1）P＜0.05.（D、E、F、G）平板克隆形成實驗，實驗組EPS為1 mg／mL，2）P＜0.01.Fig.1 （A）Microscopic examination revealed morphological changes in the CNE1 and CNE2 cells following exposure to EPS（1.0mg／m L）respectively（40×）.（B、C）Cells were treated with increasing doses of PSZ for 24，48 h in vitro.（D、E、F、G）Cells were plated for colony-forming assays as described in Materials and Methods.

2.2 EPS作用鼻咽癌細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量液泡是通過胞飲作用形成的

倒置熒光顯微鏡下觀察可見，細(xì)胞松弛劑Cytochalasin D（CytoD）和EPS（1 mg／mL）處理組分別與空白對照組及LY處理組相比，熒光信號強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（圖2A）.通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞平均熒光信號強(qiáng)度，CytoD處理組熒光強(qiáng)度強(qiáng)于EPS組，P＜0.01，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異（圖2B），說明CytoD干擾細(xì)胞骨架形成后并沒有影響細(xì)胞對胞外物質(zhì)的攝取能力.

圖2 EPS對細(xì)胞攝取熒光示蹤劑Lucifer Yellow（LY）的影響Fig.2 Vacuoles incorporate the extracellular fluid-phase tracer Lucifer yellow

2.3 c-fos、ARF6、DUSP1在EPS處理的鼻咽癌細(xì)胞CNE1／2中的表達(dá)有顯著差異

CNE1／2細(xì)胞經(jīng)EPS處理后，c-fos、ARF6、c-myc基因表達(dá)均下降（P＜0.05，圖3A）.EPS（1 mg／mL）處理細(xì)胞24 h后，與對照組相比，ERK、c-myc、DUSP1、c-jun蛋白表達(dá)無明顯改變，p-ERK1／2、c-fos、p-DUSP1蛋白表達(dá)明顯降低（圖3B）.

圖3 （A）實時定量PCR分析對照組與EPS處理組細(xì)胞c-fos、DUSP1和ARF6的表達(dá)差異.（B）細(xì)胞系中ERk1／2、p-ERk1／2、DUSP1、p-DUSP1和c-fos表達(dá).Fig.3 （A）Real-time qPCR analysis of c-Fos，DUSP1 and ARF6 expression in CNE1 and CNE2 cells either untreated or treated with EPS.（B）Immunoblot analysis of ERK，p-ERK，DUSP1，p-DUSP1 and c-fos expression in the indicated cell lines.

2.4 EPS可能通過抑制ARF6／ERK1／2／c-fos通路及DUSP1磷酸化介導(dǎo)巨泡式死亡過程

分別使用小分子c-fos抑制劑T-5224（10 μmol／L）和DUSP1抑制劑BCI（8μmol／L）處理鼻咽癌、肝癌Hep-3b和結(jié)腸癌EC-109細(xì)胞，顯示T-5224或BCI均能誘導(dǎo)CNE1／2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生大量液泡，對Hep-3b和EC-109細(xì)胞則無影響（圖4A）.與對照組相比，c-fos及DUSP1抑制劑組細(xì)胞活性明顯降低，P＜0.01（圖4B）.而當(dāng)過表達(dá)c-fos及ARF6之后，再使用EPS處理細(xì)胞并孵育24 h后，顯微鏡下可見與EPS處理組及c-fos、DUSP1抑制劑處理組相比，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變（圖4C）.蛋白免疫印跡實驗結(jié)果表明，ARF6過表達(dá)后，p-DUSP1表達(dá)明顯抑制，p-ERK1／2和c-fos水平顯著升高.過表達(dá)c-fos后，ARF6表達(dá)降低，當(dāng)干擾c-fos的表達(dá)時，ARF6、P-DUSP1及p-ERK1／2蛋白表達(dá)增加（圖4D），說明ARF6是ERK1／2級c-fos的上游基因，DUSP1可能通過磷酸化起到對c-fos的調(diào)控作用.1 mg／mL EPS處理CNE1／2細(xì)胞24 h后，免疫熒光顯微鏡下觀察到c-fos在核內(nèi)的表達(dá)大大減少（圖4E），猜想EPS可能通過抑制c-fos進(jìn)入核內(nèi)而影響其轉(zhuǎn)錄進(jìn)而介導(dǎo)巨泡式死亡過程.

圖4 （A）分別使用T-5224或BCI處理CNE1、CNE2、Hep3b、EC109細(xì)胞24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化（40×）.（B）CCK8法檢測細(xì)胞增殖抑制率；（C）ARF6及c-fos過表達(dá)的CNE2細(xì)胞在EPS處理后的形態(tài)學(xué)變化（40×）.（D）蛋白免疫印跡分析各組c-fos、DUSP1、ARF6、p-ERK1／2蛋白的表達(dá).（E）免疫熒光法檢測經(jīng)EPS處理或未經(jīng)EPS處理的CNE1和CNE2細(xì)胞中c-fos的表達(dá)水平和分布（40×）.Fig.4 （A）CNE1，CNE2，Hep3b，EC109 cells were treated with T-5224 or BCI for 24 h（40×）.（B）Inhibition effect of EPS，T-5224，BCIon cell proliferation in vitro.（C）The CNE2 cellwere transfected with ARF6 or c-fos and cultured for48 h and then treated with EPS for another 24 h（40×）.Western blot analysis the expression of c-fos，DUSP1，ARF6，P-erk in each group.（E）Expression levels and local of c-fosweremeasured by immunofluorescence in CNE1 and CNE2 cells treated with orwithout EPS（40×）.

2.5 EPS抑制荷鼻咽癌腫瘤裸鼠移植瘤的生長

成瘤第16天至第30天，對照組裸鼠腫瘤生長速度快于EPS處理組（表2－1）.對照組和實驗組裸鼠質(zhì)量均增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5C，P＞0.05）.第31天處死裸鼠，測量瘤質(zhì)量（表2－2）.0.25 g／kg EPS處理組腫瘤質(zhì)量（0.64±0.52）g（P＜0.05），明顯低于對照組（1.05±0.36）g.取裸鼠移植瘤組織，制作石蠟切片，通過免疫組化實驗，在顯微鏡下觀察目的蛋白的表達(dá)情況.結(jié)果顯示，EPS處理組與對照組相比，ARF6、c-fos和p-dusp1表達(dá)明顯下調(diào)（圖5E），與細(xì)胞水平一致，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

表2－1 化香樹果序醇提物對CNE2鼻咽癌荷瘤裸鼠體質(zhì)量的影響Table 2－1 Effect of EPS on body weight of CNE2 nasopharyngeal carcinoma bearing nudem ice

表2－2 治療后各組裸鼠瘤體積、瘤質(zhì)量及抑瘤率的比較Table 2－2 Comparison of tumor volume，tumor weight and tumor inhibition rate in nude m ice of each group after treatment

圖5 （A）腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量；（B）裸鼠體質(zhì)量差；（C）瘤質(zhì)量變化；（D）裸鼠移植瘤組織的HE染色（40×）；（E）c-fos及p-DUSP1蛋白在移植瘤組織中的表達(dá)（40×）.Fig.5 （A）The tumor volume and tumor weight.（B）The nude body weight of both control group and the experimental group were increased.（C）The weight of tumor in each group.（D）H＆E staining of xenograft tumor from nudemice injected with PBS or EPS（40×）.（E）The expression of c-fos and p-DUSP1 protein in the transplanted tumor tissue（40×）.

2.6 巨泡式死亡的可能信號機(jī)制

根據(jù)實驗結(jié)果，推測化香樹果序醇提物誘導(dǎo)鼻咽癌CNE1／2細(xì)胞死亡的可能機(jī)制為：抑制ARF6／ERK1／2／c-fos信號通路及DUSP1磷酸化途徑.藥物激活RAS／RAC1，進(jìn)而抑制ARF6／ERK1／2磷酸化，ERK1／2接受上游的級聯(lián)反應(yīng)信號，可以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子c-fos，從而參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控.DUSP1作為核蛋白通過去磷酸化抑制c-fos表達(dá)來參與巨泡式死亡過程.因此得出以下機(jī)制路線圖（圖6）：

圖6 巨泡式死亡可能的信號機(jī)制Fig.6 Possible signalingmechanism of Methuosis death

3 討論

在倒置顯微鏡下觀察到EPS作用于鼻咽癌細(xì)胞CNE1／2后，細(xì)胞發(fā)生了巨泡式死亡現(xiàn)象.MTT實驗結(jié)果顯示EPS對鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制作用呈時間、濃度依賴性.平板克隆形成實驗顯示EPS對鼻咽癌細(xì)胞生存的長期影響是明顯的.哺乳動物細(xì)胞的內(nèi)吞作用根據(jù)機(jī)制可分為吞噬作用、吞飲作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用3種.只有吞噬作用依賴偽足的形成，偽足的伸出是由肌動蛋白參與的，據(jù)此，我們設(shè)計了熒光示蹤劑標(biāo)記實驗，CytoD破壞細(xì)胞骨架形成后對熒光黃的攝取并未減少，說明液泡的大量積聚與EPS促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞有關(guān).CNE1／2細(xì)胞經(jīng)EPS處理后，ARF6、c-fos、p-DUSP1基因蛋白表達(dá)明顯下降.T-5224或BCI處理鼻咽癌細(xì)胞后均發(fā)生類似巨泡式死亡現(xiàn)象，而分別過表達(dá)c-fos與ARF6后，巨泡式死亡過程也能被逆轉(zhuǎn).ARF6過表達(dá)后，p-DUSP1表達(dá)減少，p-ERK1／2和c-fos蛋白表達(dá)升高.過表達(dá)cfos時，ARF6表達(dá)降低.干擾c-fos的表達(dá)后，ARF6、P-DUSP1及p-ERK1／2表達(dá)增加.這些結(jié)果表明，ARF6作為ERK1／2及c-fos的上游效應(yīng)器在巨泡式死亡過程中發(fā)揮作用，DUSP1并未對ARF6／ERK1／2產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)，而是通過去磷酸化對轉(zhuǎn)錄因子c-fos有一定的調(diào)節(jié)作用，提示在EPS誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞死亡過程中，DUSP1可能作為一個獨立于MAPK通路的關(guān)鍵靶點發(fā)揮作用.免疫熒光實驗進(jìn)一步證實EPS能夠阻止c-fos進(jìn)入核內(nèi)，使得c-fos無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá).由裸鼠鼻咽癌移植瘤模型證實，EPS在體外對鼻咽癌也有抑制作用.對移植瘤組織免疫組化實驗也證實，實驗組裸鼠移植瘤組織中c-fos及p-DUSP1呈低表達(dá)，與對照組相比有顯著差異.

EPS通過抑制ARF6／ERK1／2／c-fos通路及DUSP1磷酸化從而誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生巨泡式死亡.在這個過程中，EPS作用后使ARF6蛋白失活，巨胞飲小體不能回到細(xì)胞膜，同時ERK1／2磷酸化受到抑制，影響核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子c-fos的表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖與分化.而DUSP1在巨泡式死亡中的具體作用還有待更深一步的研究.

目前已發(fā)現(xiàn)多種物質(zhì)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生巨泡式死亡，包括小分子物質(zhì)及中藥提取物，為細(xì)胞死亡的途徑增添了新的內(nèi)容和方向.在此基礎(chǔ)上我們將進(jìn)一步深入探討其具體作用機(jī)制，為腫瘤治療提供新的更有效、毒副作用更小的藥物.

作者貢獻(xiàn)聲明

涂維：參與實驗設(shè)計、細(xì)胞及動物實驗、數(shù)據(jù)分析及文章的書寫；劉金坤：參與實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析；沈洪貴、莫慧婷：參與動物實驗；蔡紅兵：實驗設(shè)計指導(dǎo).

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在的利益沖突.