郝晨笛， 蘇儉生

（上海牙組織修復與再生工程技術(shù)研究中心，同濟大學口腔醫(yī)學院，同濟大學附屬口腔醫(yī)院口腔修復科，上海 200072）

牙釉質(zhì)是在多種細胞因子調(diào)控下，由成釉細胞合成、分泌有機基質(zhì)并不斷礦化成熟形成的高度礦化組織[1]。 成熟的牙釉質(zhì)由95%～97%的無機物和小于1%的有機物組成，是無細胞性組織，因而無法進行生理性自行修復[2]。 在釉質(zhì)基質(zhì)形成及礦化的過程中， 如基因調(diào)控出現(xiàn)異常而引起遺傳學水平改變，則會導致牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)異常，即釉質(zhì)發(fā)育缺陷性疾病[3]。 之前對釉質(zhì)發(fā)育的分子機制研究大多圍繞著編碼釉基質(zhì)蛋白的牙源性基因[4]，如釉原蛋白 （amelogenin，AMELX）、 釉 蛋 白 （enamelin，ENAM）、成釉蛋白（ameloblastin，AMBN）、釉成熟蛋白（amelotin，AMTN）基因，以及編碼釉基質(zhì)蛋白水解酶的基因，如金屬基質(zhì)蛋白酶-20（matrix metalloproteinase-20，MMP-20） 和激肽釋放酶 4（kallikrein 4，KLK4）基因進行研究。 此外，BMP 家族、Wnt 家族等信號通路與牙發(fā)育的研究也取得了重大進展[5]，但釉質(zhì)發(fā)育的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和機制還有待探究。

隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，原本認為不具有蛋白質(zhì)編碼功能的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA） 可通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后機制來調(diào)控基因的表達。 MicroRNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA） 作為 2 種調(diào)控性非編碼RNA，已被證實廣泛參與了細胞周期與分化等多個生物學過程。 近年來， 越來越多的證據(jù)表明，miRNA 是牙齒發(fā)育信號通路的重要調(diào)節(jié)因子[6-8]。Funada 等[9]發(fā)現(xiàn)，miR875-5p 通過血小板衍生生長因子（plateletderived growth factor，PDGF）信號通路誘導間充質(zhì)細胞向牙上皮細胞遷移并凝結(jié)，參與上皮-間充質(zhì)相互作用，從而調(diào)控成釉細胞分化及釉質(zhì)形成等牙齒形態(tài)發(fā)生過程。 2011 年，Salmena 等[10]提出，lncRNA 可作為競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA） 結(jié)合 miRNA， 從而調(diào)控miRNA 對mRNA 的抑制作用， 最終實現(xiàn)對細胞功能的調(diào)控。 此前已有研究證實，lncRNA 參與了骨形成等器官發(fā)育過程[11]，但lncRNA 是否參與調(diào)控牙發(fā)育還未見報道。 本研究旨在通過對比觀察lincRNA-EPS 基因敲除型和野生型小鼠下頜磨牙的差異，探究基因間長鏈非編碼RNA lincRNA-EPS 對牙釉質(zhì)發(fā)育的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 lincRNA-EPS 基因敲除純合型C57BL/6J 小鼠（knockout，KO）由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，C57BL/6J 小鼠 （wild type，WT）由同濟大學實驗動物中心提供。 實驗動物均飼養(yǎng)于上海牙組織修復與再生工程技術(shù)研究中心SPF級實驗動物房中。選用雄性及雌性8～10 周齡KO 組和WT 組小鼠，按1∶2 的比例將2 組小鼠分別合籠，胎齡計算以新生小鼠出生當日中午為出生后（postnatal，PN）第 0.5 天。選用 PN0.5 及 8 周齡 KO 和 WT小鼠用于本研究。 經(jīng)同濟大學附屬口腔醫(yī)學院倫理委員會許可對實驗動物進行操作（編號：〔2018〕倫審字 026 號）。

1.1.2 實驗試劑及設(shè)備 樹脂包埋劑（Technovit公司，德國），TRIzol 試劑盒（TaKaRa 公司，日本），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；micro-CT 機（SCANCOMedical 公司， 瑞士）， 體視顯微鏡（Leica公司，德國），掃描電子顯微鏡（Hitachi 公司，日本），X 射線能譜儀 （IXRF 公司， 美國）， 實時熒光定量PCR 儀（羅氏公司，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因型鑒定 剪取PN0.5 KO 和WT 小鼠約1 mm 鼠尾片段， 小鼠基因組使用引物對P1/P2，P3/P4 分別進行擴增，聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）鑒定 lincRNA-EPS 基因。 PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃ 10 s，63 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，34 個循環(huán) 后 68 ℃ 延 伸 5 min。 P1 引 物 序 列 ：5′ -CCAGGATGTCAGAAGAGGAAGC-3′；P2 引物序列：5′-ACACAGAGCAGC-ATAAGGACA-3′；P3 引 物 序列 ：5′-AAGGGACA-GGAGGAGGGATTGG-3′；P4 引物序列：5′-CTAG-GGCATACTGAGGAGGTTTTG-3′。

1.2.2 取材 取8 周齡雄性KO 和WT 小鼠， 將其頸椎脫臼處死并完整解剖分離其雙側(cè)下頜骨（含牙），剃凈附著軟組織后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗 3 次，置于 4%多聚甲醛溶液中以4 ℃固定24 h，于體視顯微鏡下觀察并拍攝其外形， 隨后長期保存于0.5%多聚甲醛溶液中，用于后續(xù) X 線檢查、micro-CT 掃描、 掃描電鏡（SEM）分析及 X 射線能譜儀（EDX）分析。 選取 PN0.5 同窩出生的KO 小鼠和WT 小鼠各6～9 只， 體視顯微鏡下解剖分離小鼠雙側(cè)下頜第一磨牙牙胚，用于實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）檢測。

1.2.3 X 線和micro-CT 掃描 將固定完成的8 周齡KO 和WT 小鼠下頜骨放置于micro-CT 樣本掃描管中進行掃描（管電壓：70 kV；管電流：200 μA；管精度：14.4 μm；曝光時間：300 ms），掃描完成后通過軟件對樣本進行三維重建及分析。

1.2.4 RT-qPCR 檢測 用 TRIzol 法分別提取PN0.5 KO 和WT 小鼠下頜第一磨牙牙胚總RNA，使用TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；參照 SYBR 體系， 配制 RT-qPCR 反應(yīng)體系。 以GAPDH 作為內(nèi)參對照，置于RT-qPCR 儀上反應(yīng)，檢測KO 和WT 小鼠牙胚中釉質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因AMELX、ENAM、AMBN、AMTN 的 mRNA 表達水平差異。 引物序列見表1。

表1 釉質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因引物序列表Table 1 Primer sequence of amelogenesis related genes

1.2.5 SEM 分析 固定好的8 周齡KO 和WT 小鼠下頜骨用PBS 沖洗3 遍， 去離子水超聲蕩洗5 min，干燥，表面噴金，SEM 分析其表觀形貌。掃描完成的樣本用 PBS 沖洗， 用 50%、70%、80%、90%和 100%的乙醇溶液梯度脫水后浸入樹脂包埋劑中，光固化13.5 h 形成樹脂包埋塊。 以下頜磨牙近遠中方向為軸拋光至觀察層面，去離子水蕩洗5 min，37%磷酸酸蝕30 s，5.25%次氯酸鈉浸泡1 min， 去離子水超聲蕩洗10 min，干燥，噴金，SEM 觀察釉質(zhì)超微結(jié)構(gòu)。

1.2.6 EDX 分析 固定好的 8 周齡 KO 及 WT 小鼠下頜骨用PBS 沖洗 3 遍， 去離子水超聲蕩洗10 min，將樣本固定在標本載物臺上，每個樣本選擇3 個掃描位點，用X 射線能譜儀檢測其元素組成。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)分布及方差齊性檢驗后使用。 采用t 檢驗法分析比較2 組之間的差異，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 鑒定轉(zhuǎn)基因動物基因型

PCR 產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果如圖1 所示。WT 小鼠擴增出382 bp 條帶，lincRNA-EPS KO 小鼠擴增出825 bp條帶。經(jīng)鑒定，通過繁殖獲得的純合型lincRNA-EPS缺失的子代可用于后續(xù)實驗。

圖1 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoresis of PCR products

2.2 lincRNA-EPS 基因敲除導致小鼠牙釉質(zhì)缺損

8 周齡KO 和WT 小鼠下頜骨體視顯微鏡下圖像及micro-CT 三維重建圖像（圖2）顯示，與WT小鼠相比，KO 小鼠下頜磨牙舌側(cè)出現(xiàn)大面積牙體組織缺損，且缺損程度由近中向遠中方向逐漸降低，釉質(zhì)色澤和透明度未見明顯差異。 X 線圖像顯示，KO 和WT 小鼠下頜骨X 線透光密度無明顯差異。

圖2 8 周齡KO 和WT 小鼠下頜磨牙大體觀察Figure 2 Microscopic evaluation of the mandibular molars from KO and WT mice at 8-week-old

2.3 lincRNA-EPS 調(diào)控釉質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因的表達

RT-qPCR 結(jié)果如圖 3 所示， 與 WT 組小鼠相比，KO 組小鼠釉質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因AMELX、AMBN、ENAM、AMTN 的 mRNA 表達量均顯著下調(diào) （P＜0.05）。

圖3 KO 和WT 小鼠釉質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因mRNA 表達水平Figure 3 mRNA expression level of amelogenesis-related genes in KO and WT mice

2.4 lincRNA-EPS 缺失導致小鼠釉質(zhì)表面形貌及微觀結(jié)構(gòu)改變

WT 和KO 小鼠下頜磨牙表面形貌掃描電鏡圖像如圖4 所示。WT 小鼠牙體硬組織結(jié)構(gòu)完整，釉質(zhì)表面光滑平坦， 牙尖可見正常生理性磨損;KO 小鼠牙體硬組織大面積缺損，第一、第二、第三磨牙舌側(cè)正常牙尖結(jié)構(gòu)（L1、L2、L3）均出現(xiàn)一定程度的磨耗缺損， 第一磨牙甚至出現(xiàn)凹坑狀缺損。 放大圖像（圖4D）中見KO 小鼠第一磨牙釉質(zhì)邊緣結(jié)構(gòu)粗糙，牙本質(zhì)暴露，可見數(shù)條溝壑狀裂紋（箭頭處）。

圖4 8 周齡WT 與KO 小鼠下頜磨牙表面形貌分析（×5）Figure 4 Morphology of mandibular molars from WT and KO mice at 8-week-old (×5)

WT 及KO 小鼠下頜磨牙蝕刻后釉質(zhì)區(qū)橫截面SEM 圖像如圖 5A、D 所示，WT 小鼠下頜磨牙釉柱排列整齊有序，呈螺旋狀交替；KO 小鼠下頜磨牙釉柱排列紊亂，且不連續(xù)，呈斷裂狀（箭頭處）。 WT 及KO 小鼠下頜第一、 第二磨牙鄰接區(qū)釉質(zhì)圖像如圖5B、E 所示，WT 小鼠釉質(zhì)邊緣無釉柱結(jié)構(gòu)光滑平整，KO 小鼠無釉柱結(jié)構(gòu)被破壞， 表面粗糙 （箭頭處）。 放大圖像（圖 5C、F）下見 WT 小鼠單個釉柱內(nèi)羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)排列緊密有序，KO 小鼠釉柱內(nèi)羥基磷灰石晶體間出現(xiàn)間隙（箭頭處）。

圖5 8 周齡WT 和KO 小鼠下頜磨牙橫斷面釉質(zhì)結(jié)構(gòu)分析Figure 5 SEM micrographs of enamel cross sections of mandibular molars from WT and KO mice at 8-week-old

2.5 lincRNA-EPS 的缺失對釉質(zhì)表面鈣/磷比無影響

EDX 分析結(jié)果如表 2 所示。 KO 組和 WT 組小鼠牙釉質(zhì)中含有均勻分布的鈣、磷等微量元素，2 組小鼠間釉質(zhì)的鈣/磷質(zhì)量百分比和原子百分比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 WT 和 KO 小鼠釉質(zhì) EDX 分析結(jié)果（）Table 2 EDX analysis of enamel in WT and KO mice（）

表2 WT 和 KO 小鼠釉質(zhì) EDX 分析結(jié)果（）Table 2 EDX analysis of enamel in WT and KO mice（）

組別 EDX 分析結(jié)果鈣/磷質(zhì)量百分比/wt% 鈣/磷原子百分比/at%WT 組 2.16±0.16 1.62±0.17 KO 組 2.29±0.09 1.65±0.15 P 值 0.07 0.66

3 討論

Hu 等[12]在 2011 年首次發(fā)現(xiàn) lincRNA-EPS，并獲取其全長序列， 對該基因進行功能注釋后發(fā)現(xiàn)，lincRNA-EPS 具有抗凋亡的活性， 此后對lincRNAEPS 的研究大多集中在免疫炎癥調(diào)節(jié)方面。 為探究lincRNA-EPS 是否參與牙發(fā)育過程， 我們前期通過CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了 lincRNA-EPS 基因敲除小鼠模型， 對小鼠下頜磨牙進行表型研究， 發(fā)現(xiàn)lincRNA-EPS 基因敲除小鼠的牙齒數(shù)量、 萌出時間與野生型小鼠相比沒有差異， 但成年lincRNA-EPS基因敲除小鼠下頜磨牙區(qū)釉質(zhì)出現(xiàn)大面積缺損，提示lincRNA-EPS 參與了小鼠下頜磨牙牙釉質(zhì)發(fā)育及穩(wěn)態(tài)維持過程[13]。

哺乳動物牙釉質(zhì)的發(fā)育是在多種信號分子和轉(zhuǎn)錄因子有序誘導下完成的動態(tài)過程[14]， 經(jīng)過了2 個相互交疊的時期：分泌期和成熟期。 確定牙釉質(zhì)發(fā)育的影響因子及調(diào)控機制對于了解牙釉質(zhì)發(fā)育過程及預(yù)防釉質(zhì)發(fā)育缺陷性疾病具有重要意義，還可為牙齒再生的研究提供理論基礎(chǔ)。 在釉質(zhì)形成的分泌期，成釉細胞合成并分泌釉基質(zhì)蛋白（enamel matrix proteins，EMPs）直至達到應(yīng)有的厚度。 羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）晶體是組成牙釉質(zhì)的主要成分。 研究表明，EMPs 在釉質(zhì)分泌期誘導HAP 晶體沿c 軸生長至全長，從而參與控制其形成的大小形態(tài)、生長方向及生長速度[15]。Fan 等[16]發(fā)現(xiàn)，釉原蛋白和釉蛋白還可通過合作效應(yīng)控制大分子自組裝，從而影響晶體形態(tài)。 為探究lincRNA-EPS 是否通過對EMPs 的分泌產(chǎn)生阻礙從而影響釉質(zhì)發(fā)育， 本研究對處于EMPs 分泌成熟交疊時期的磨牙牙胚進行mRNA 表達量分析。 與野生型小鼠相比，lincRNAEPS 基因敲除小鼠中 AMELX、ENAM、AMBN、AMTN的 mRNA 表達量均顯著降低（P＜0.05）,說明 lincRNAEPS 參與了EMPs 的分泌成熟過程， 并推測其參與調(diào)控了釉質(zhì)晶體的生長。

當釉質(zhì)發(fā)育進入成熟期，成釉細胞分泌基質(zhì)蛋白酶MMP-20 和KLK4 降解EMPs，釉質(zhì)中的有機成分逐漸被無機成分所代替，無機成分最終可達釉質(zhì)重量的95%～97%[17]。 HAP 作為釉質(zhì)中主要的無機物， 其交織排列組成了釉質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)——釉柱，釉柱又按一定規(guī)律緊密排列， 旋轉(zhuǎn)扭曲成束狀結(jié)構(gòu)[18]，這樣的化學成分和結(jié)構(gòu)組成使釉質(zhì)擁有了能夠長期使用的機械強度。 為探究lincRNA-EPS 基因敲除小鼠牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，通過掃描電鏡對釉質(zhì)超微結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)lincRNA-EPS 基因敲除小鼠下頜磨牙釉柱排列紊亂，螺旋狀的有序結(jié)構(gòu)被破壞，釉柱內(nèi)的HAP 晶體排列出現(xiàn)間隙，釉質(zhì)外層無釉柱結(jié)構(gòu)區(qū)域遭到破壞。 以上研究結(jié)果表明，lincRNA-EPS 的缺失造成EMPs 表達的下調(diào)，并可能因此影響了其成熟時的吸收過程， 造成HAP晶體及釉質(zhì)排列紊亂。 由于無序的牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)會使釉質(zhì)的應(yīng)力強度大大降低，因此，在進行咀嚼、咬合等正常生理活動時，lincRNA-EPS 基因敲除小鼠的釉質(zhì)結(jié)構(gòu)更易被破壞， 加速了牙體組織的磨耗，甚至會出現(xiàn)與人牙隱裂相似的癥狀。 為進一步探討lincRNA-EPS 缺失對小鼠釉質(zhì)礦化的影響， 本研究從X 線影像和EDX 2 個層面進行礦化分析。 研究結(jié)果顯示，2 組小鼠礦化程度及鈣/磷比值間差異無統(tǒng)計學意義，說明lincRNA-EPS 基因敲除后，小鼠釉質(zhì)晶體的排列雖然發(fā)生了變化，但晶體的原子結(jié)構(gòu)及原子量并未改變。

綜上所述，lincRNA-EPS 的缺失影響了釉基質(zhì)蛋白分泌和吸收的過程， 并引發(fā)牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)的紊亂，最終導致了釉質(zhì)結(jié)構(gòu)的缺損。 研究首次證明了lincRNA-EPS 在牙釉質(zhì)發(fā)育過程中的調(diào)控作用，為進一步探究釉質(zhì)發(fā)育機制提供了重要研究基礎(chǔ)。