丁允鵬， 陶狄坷， 張 帥， 孫 瑤

（上海牙組織修復與再生工程技術(shù)研究中心，同濟大學口腔醫(yī)學院，同濟大學附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海 200072）

初級纖毛是細胞表面的毛狀感受器，存在于多種細胞類型中。 目前，初級纖毛已經(jīng)被證實能夠感受化學信號、機械力，并且廣泛參與多種組織器官的發(fā)育，能夠調(diào)控細胞增殖、譜系分化和維持干細胞干性[1-2]。 初級纖毛相關(guān)基因突變引起的纖毛病，如 Verma-Naumoff 綜合征、Senior-Loken 綜合征、Meckel-Gruber 綜合征等常出現(xiàn)短指、短肋等長骨發(fā)育畸形[3-5]。 在小鼠中敲除初級纖毛相關(guān)基因也會導致長骨發(fā)育畸形，如在表達轉(zhuǎn)錄因子7（transcription factor 7，Sp7） 的細胞中敲除纖毛轉(zhuǎn)運蛋白 80（intraflagellar transport 80，Ift80）會抑制成骨細胞分化[6]，在表達 2 型膠原（collagen 2，COL2）的軟骨細胞中敲除Ift88 會導致小鼠四肢短小， 生長板結(jié)構(gòu)紊亂[7]。 上述研究結(jié)果說明，纖毛對于長骨的生長發(fā)育有重要影響，但其具體機制還有待進一步研究。

長骨生長的方式為軟骨內(nèi)成骨，其生長主要依賴于長骨中特異性的生長板結(jié)構(gòu)。 生長板由軟骨細胞構(gòu)成，生長板軟骨細胞沿長骨長軸向兩端增殖使長骨增長。 按照軟骨細胞的生物學特征可以將生長板分為4 層：靜息層、增殖層、前肥大層和肥大層[8]。已有研究證實,軟骨生長板中有大量的細胞纖毛存在[9]，但是初級纖毛在生長板各層的分布規(guī)律有待系統(tǒng)研究。 研究軟骨中初級纖毛分布特點，對闡釋生長板發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持具有重要意義。 我們擬通過分析初級纖毛在1、4、8 周齡小鼠股骨生長板的分布規(guī)律來揭示纖毛和生長板發(fā)育及穩(wěn)態(tài)維持的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 小鼠取材固定和切片

取 1、4、8 周齡野生型 C57BL/6J 小鼠，用 1%戊巴比妥鈉對其麻醉后使用4%多聚甲醛進行體循環(huán)固定， 剔除軟組織后分離雙側(cè)股骨，4%多聚甲醛固定48 h，10%乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）脫鈣21 d。 脫鈣完成后用清水沖洗 30 min，脫水浸蠟，石蠟包埋。 以 4 μm 的厚度進行石蠟切片， 隨后進行甲苯胺藍和免疫熒光染色。

1.2 甲苯胺藍染色

將石蠟切片置于65 ℃烘箱60 min， 脫蠟并水化。 甲苯胺藍染液（Sigma 公司，美國）室溫孵育30 min，65 ℃烘箱烘干，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 免疫熒光染色

用透明質(zhì)酸酶37 ℃抗原修復60 min， 磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffered saline，PBS） 洗 3 次，0.5%Triton 室溫打孔 10 min，PBS 洗 3 次，1%小牛血清封閉60 min，吸棄血清，按1∶200 的比例稀釋并孵育COL2（博士德生物工程有限公司，中國），ADP核糖基化因子樣蛋白13b （ADP ribosylation factor like GTPase13b，Arl13b） 或乙?；⒐艿鞍祝╝cetylated tubulin，ACE-tubulin）抗體抗體（Proteintech 公司,美國），4 ℃孵育過夜，用 PBS 洗 3 次，37 ℃孵育熒光二抗 60 min，PBS 洗 3 次，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復染，37 ℃孵育 5 min，用 PBS 洗 3 次，用防淬滅封片劑封片。

1.4 軟骨細胞培養(yǎng)

取 2 只 1 周齡野生型 C57BL6/J 小鼠雙側(cè)股骨生長板，吹打洗去表面骨髓組織，將生長板置于4 mg/mL 的Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司,美國）中，37 ℃消化 40 min，用 PBS 10 倍稀釋，300×g 離心 10 min，3 mL PBS 重懸，70 μm 濾網(wǎng)過濾， 將過濾所得細胞懸液接種于60 mm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并記為P0 代，將P1 代用于實驗。

1.5 軟骨細胞肥大化誘導

將P1 代軟骨細胞以5×105個/孔的密度接種于6 孔板。肥大軟骨細胞誘導液構(gòu)成：1 nmol/L 地塞米松（Sigma 公司,美國）；50 μg/mL 抗壞血酸（Sigma 公司，美國）；100 μg/mL 丙酮酸鈉；1%ITS 添加物（賽業(yè)生物科技有限公司，中國）；1%雙抗（凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國）；5 mmol/L 甘油磷酸鈉（Sigma 公司，美國）。

1.6 細胞免疫熒光染色

4%多聚甲醛于 4 ℃ 下固定細胞 60 min，用PBS 沖洗 3 次，0.5%Triton×100 室溫打孔 5 min，用PBS 液沖洗 3 次，1%小牛血清室溫封閉 60 min， 按照 1∶200 的比例孵育 COL2，10 型膠原（collagen10，COL10）抗體（博士德生物工程有限公司，中國），Arl13b 抗體 （Proteintech 公司， 美國），4 ℃過夜，用PBS 洗 3 次， 孵育二抗，37 ℃孵育 60 min， 用 PBS洗 3 次，DAPI 復染，37 ℃孵育 5 min， 用 PBS 洗 3 次，將細胞爬片取出，于載玻片上封片。

1.7 RT-qPCR

用 TRIzol 法（TaKaRa 公司，日本）提取細胞總RNA，使用 PrimeScriptTMRT 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）進行逆轉(zhuǎn)錄，然后使用SYBR Mix 和LightCycler96（Roche 公司,瑞士）進行 RT-qPCR 實驗及分析， 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參（引物序列見表 1），通過 2-ΔΔCT法計算 mRNA 的倍數(shù)變化，并根據(jù)對照組對數(shù)據(jù)進行標準化。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequence in RT-qPCR

1.8 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學差異分析使用SPSS 22.0 軟件進行兩獨立樣本t 檢驗或方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 長骨發(fā)育過程中生長板軟骨細胞存在初級纖毛

通過甲苯胺藍染色，我們發(fā)現(xiàn)小鼠股骨生長板在其 1、4 周時較厚，8 周時， 隨著股骨發(fā)育接近尾聲，股骨生長板逐漸變薄（圖1A～C）；在所有的時間點，生長板的軟骨細胞均存在初級纖毛（圖1D～J），隨著年齡增長，生長板軟骨細胞中的纖毛細胞比例降低。

圖1 長骨發(fā)育過程中生長板軟骨細胞存在初級纖毛Figure 1 Primary cilia of chondrocyte in femur growth plate of developing mouse

2.2 初級纖毛主要存在于生長板靜息層、增殖層和前肥大層

為了進一步研究初級纖毛在生長板的分布規(guī)律，我們通過免疫熒光染色共同觀察軟骨細胞標志物COL2 和初級纖毛標志物乙?；⒐艿鞍祝ˋCE-tubulin），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初級纖毛主要分布于靜息層、增殖層和前肥大層，肥大層的肥大軟骨細胞少有初級纖毛（圖 2）。

圖2 有纖毛的軟骨細胞主要存在于靜息層、增殖層和前肥大層Figure 2 Ciliated chondrocytes mainly exist in resting zone, proliferative zone and prehypertrophic zone

2.3 生長板軟骨細胞肥大化過程中初級纖毛略減少

為了研究初級纖毛在軟骨細胞肥大化中的作用，我們在體外培養(yǎng)了軟骨細胞并誘導其向肥大軟骨細胞分化，7 d 后， 肥大軟骨細胞特異性基因COL10、Prg4 表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義，免疫熒光顯示大部分細胞表達 COL10 （圖 3A、B、D、E），肥大軟骨細胞誘導成功。 同時我們發(fā)現(xiàn)，在誘導7 d后，初級纖毛細胞的比例略降低，但差異沒有統(tǒng)計學意義（圖 3I）。

圖3 生長板軟骨細胞肥大化過程中，初級纖毛略減少Figure 3 The primary cilia were slightly reduced during growth plate chondrocytes differentiated into hypertrophic chondrocytes

2.4 提高有纖毛細胞比例伴隨肥大軟骨細胞標志性基因的表達降低

本實驗通過無血清饑餓軟骨細胞48 h 阻滯細胞周期，顯著提升了有纖毛細胞的比例（圖4A～E），之后進行肥大化誘導，7 d 后RT-qPCR 和細胞免疫熒光結(jié)果顯示，經(jīng)過無血清饑餓的軟骨細胞COL10 表達顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，Prg4 的表達略低于對照組，但差異沒有統(tǒng)計學意義（圖4F、G）。

3 討論

長骨生長板有一套維持穩(wěn)態(tài)的機制，靜息層的骨骼干細胞周期性產(chǎn)生軟骨祖細胞，軟骨祖細胞向增殖層遷移并快速增殖促進長骨沿長軸的生長，增殖層末端的軟骨細胞向肥大軟骨細胞分化，肥大軟骨細胞分泌軟骨基質(zhì)為骨化提供條件[10-11]。 生理條件下，增殖層軟骨祖細胞和肥大軟骨細胞維持一定的比例，軟骨祖細胞提前分化或增殖過度活躍都會導致骨骼發(fā)育異常[12]。 生長板增殖分化的調(diào)控依賴于印度刺猬因子（indian hedgehog,IHH）-甲狀旁腺激素相關(guān)肽（parathyroid hormone-related peptide,PTHrP）負反饋機制，前肥大軟骨細胞分泌的IHH 通過旁分泌作用促進軟骨祖細胞的增殖， 靜息層軟骨祖細胞在IHH 的刺激下分泌PTHrP 抑制軟骨祖細胞的增殖，并促進其向肥大軟骨細胞分化[13]。這套負反饋機制能夠抑制軟骨的過度增殖或者分化，維持生長板的動態(tài)平衡。

Arl13b 是定位在初級纖毛的小GTP 酶，ACE-tubulin 是初級纖毛軸絲的組成部分，兩者均是常用的初級纖毛標志物。 通過免疫熒光標記Arl13b 和ACE-tubulin，我們發(fā)現(xiàn)在 1、4、8 周齡小鼠長骨生長板中都存在初級纖毛，在1、4 周齡小鼠股骨生長板中初級纖毛主要存在于靜息層、增殖層、前肥大層的軟骨細胞，在分化成熟的肥大軟骨細胞中則較少觀察到初級纖毛。 小鼠股骨靜息層和增殖層存在大量有纖毛的軟骨細胞，與此前報道的軟骨細胞增殖調(diào)控機制有關(guān)。 在出生后第9 天，前肥大軟骨細胞分泌的IHH 能夠促進靜息層骨骼干細胞的產(chǎn)生[14]，同時IHH 還可以刺激增殖層軟骨細胞的快速增殖以維持生長板寬度[15]，而經(jīng)典的IHH-GLI 信號經(jīng)過初級纖毛介導。 因此，在軟骨細胞中敲除初級纖毛相關(guān)基因常導致生長板增殖層變短[16]。

初級纖毛在生長板增殖層的富集與其調(diào)控軟骨細胞增殖相關(guān)，但當軟骨細胞分化為肥大軟骨細胞后，初級纖毛會消失，并且在體外誘導軟骨細胞分化為肥大軟骨細胞后， 有纖毛細胞比例顯著降低，說明初級纖毛可能能夠抑制軟骨細胞向肥大軟骨細胞分化， 其原因尚不清楚， 這可能與經(jīng)典的Hedgehog-GLI 信號對軟骨細胞的促增殖作用有關(guān)[17-19]。 Hedgehog-GLI 信號能夠促進軟骨細胞的增殖，而初級纖毛是介導HH 信號的關(guān)鍵細胞器。 向肥大軟骨細胞分化的過程中，初級纖毛消失可能能夠抑制軟骨細胞增殖，為其向肥大軟骨細胞分化提供條件，所以在軟骨細胞分化過程中，初級纖毛會逐漸減少直至消失。 除此之外，我們發(fā)現(xiàn)有纖毛比例更高的軟骨細胞經(jīng)過肥大化誘導之后，肥大軟骨細胞標志性基因表達更低，這也提示初級纖毛可能對軟骨細胞向肥大軟骨細胞分化有抑制作用。 以往的研究認為，生長板軟骨細胞的增殖分化受生長板微環(huán)境中多種因子的調(diào)控[20]，我們通過研究初級纖毛在生長板的分布規(guī)律發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞可能通過解聚初級纖毛來抑制IHH 的促增殖作用，促進自身向肥大軟骨細胞分化，為研究生長板發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持提供了新思路。

綜上所述， 初級纖毛主要分布在生長板靜息層、增殖層和前肥大層，分化成熟的肥大層軟骨細胞初級纖毛消失。 通過無血清饑餓法提高有纖毛細胞的比例后，軟骨細胞肥大化誘導過程中，肥大軟骨細胞標志性基因表達降低。