陳紅全，王建瑛

1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 310016；2南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，江蘇 南京 211166

耐藥性仍然是治愈癌癥的主要限制因素，盡管多種化療藥物早期對腫瘤的治療效果很好，但隨著耐藥性的產(chǎn)生，常導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)［1］，對腫瘤細胞耐藥機制的研究有助于更好地治療癌癥。RNA 干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）曾被應(yīng)用于腫瘤細胞耐藥基因的篩選，但由于RNAi 不能完全抑制基因表達，而且存在廣泛的脫靶效應(yīng)，影響對基因功能的判定。CRISPR?Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）系統(tǒng)具有高效、便捷等諸多優(yōu)點，為腫瘤細胞耐藥性分子機制的解析提供了強大的工具［2］。

CRISPR?Cas 系統(tǒng)是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的免疫防御系統(tǒng)，用以對抗入侵的病毒及外源核酸［3］。目前，對Ⅱ類CRISPR?Cas系統(tǒng)中來源于釀膿鏈球菌的Streptococcus pyogenesCas9（sp?Cas9）研究最為深入，Cas9蛋白作為核酸內(nèi)切酶，在引導(dǎo)RNA 的指導(dǎo)下識別目標(biāo)DNA 序列后激活Cas9蛋白的酶切活性［4］。正是由于這種靶向功能，CRIS?PR/Cas9 系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于多物種的基因編輯、基因調(diào)控、定位成像、細胞譜系追蹤、高通量文庫篩選以及病毒檢測等領(lǐng)域［5］。目前該系統(tǒng)還存在諸多缺點，如Cas9表達載體過大，不容易被轉(zhuǎn)染進細胞；Cas9載體長時間表達，會增加脫靶的風(fēng)險［6］。因此，有必要構(gòu)建一個可誘導(dǎo)表達Cas9的穩(wěn)定細胞系，用以解決低效轉(zhuǎn)染和因Cas9 長時間表達而導(dǎo)致高脫靶風(fēng)險的問題。

慢病毒常被用于穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建，但是需要包裝病毒顆粒，費時費力，并存在感染的風(fēng)險，本研究利用便捷的PiggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，成功構(gòu)建了可誘導(dǎo)表達Cas9 的穩(wěn)定HeLa 細胞系，并證明在多個位點可以高效切割基因組；同時，我們針對人核受體基因，設(shè)計了對應(yīng)的sgRNA 文庫，在這個細胞系上進行了抗癌藥物順鉑（Cisplatin）耐藥性的篩選，以期為順鉑耐藥機制的解析打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T 和HeLa 細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）；高糖DMEM（HyClone公司，美國），胎牛血清（FBS）（Gem?ini 公司，美國），青鏈霉素（Gibco 公司，美國）；Lipo?fectamine 2000（Invitrogen 公司，美國）；強力霉素（Sigma 公司，美國）；Zeocin（Invitrogen 公司，美國）；嘌呤霉素（Merck 公司，德國）；高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TaKaRa 公司，日本）；限制性內(nèi)切酶BsaⅠ（NEB 公司，美國）；Esp3 Ⅰ（Fermentas公司，立陶宛）；多聚賴氨酸（Sigma 公司，美國）；T7EN1（NEB 公司，美國）；T 載體（TaKaRa 公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

pST1374?NLS?Flag?Cas9、pST1374?NLS?Flag?Cas9?NLS、pST1374?NLS?Flag?Cas9?NP、pST1374?Cas9?NLS 和pST1374?Cas9?SP 改自pST1374?NLS?flag?linker?Cas9（Addgene 公司，美國）［7］。用于構(gòu)建針對人RAG1基因的sgRNA表達載體通過寡聚核苷酸（oligo）在體外退火，利用BsaⅠ位點插入pGL3?U6?sgRNA?PGK?Puro 載體（Addgene 公司，美國）［7］，所用oligo 序列為hRag1?U6?Up：5′?CCGGTGTCT?GCTTTGATGGACA?3′；hRag1?U6?Down：5′?AAACT?GTCCATCAAAGCAGACA?3′。

用于高通量構(gòu)建sgRNA 的表達載體pGL3?U6?ccdB?PGK?Puro 改自pGL3?U6?sgRNA?PGK?Puro 載體。以pGL3?U6?sgRNA?PGK?Puro 為模板，利用前向特異引物和共用反向引物擴增出19N?sgRNA backbone，通過Esp3Ⅰ酶切位點，插入pGL3?U6?ccdB?PGK?Puro 載體。用于構(gòu)建sgRNA 文庫的慢病毒載體pLKO.1?U6?ccdB?PGK?Puro 改自pGL3?U6?ccdB?PGK?Puro。

針對47個核受體基因各設(shè)計2條sgRNA（表1）。共用的反向引物為T7 gRNA Esp3I Rev：5′?TTA?CACCGTCTCGTTTATGCTTCCGGCTCGTATG?3′。

表1 構(gòu)建sgRNA表達載體所用引物Table 1 Sequences of primers for constructing sgRNA expression vectors

（續(xù)表1）

PiggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)由劉澎濤教授惠贈［8］。NLS?Flag?Cas9?NLS 和Cas9?NLS 片段分別來自pST1374?NLS?Flag?Cas9?NLS 和pST1374?Cas9?NLS，IRES?hrGFP 片段擴增自pShuttle?IRES?hrGFP（Agi?lent Technologies 公司，美國），Sv40 Pro?BleoR?pA 片段擴增自pcDNA3.1?Zeo載體，以上片段通過酶切位點克隆至PiggyBac 表達載體中，構(gòu)建PB?TRE?NLS?Flag?Cas9?NLS?IRES?hrGFP?Zeo 和PB?TRE?Cas9?NLS?IRES?hrGFP?Zeo載體。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK293T 和HeLa 細胞培養(yǎng)于高糖DMEM，10%FBS，1%100×青鏈霉素中。

HEK293T 細胞利用Lipofectamine 2000 進行轉(zhuǎn)染。在12孔板中，1 μg Cas9各載體和0.5 μg sgRNA載體被共轉(zhuǎn)染到HEK293T中，72 h之后收集細胞用于下游分析。在24 孔板中，0.5 μg PB?TRE?NLS?Flag?Cas9?NLS?IRES?hrGFP?Zeo 和0.25 μg PB?CAG?rtTA載體被共轉(zhuǎn)染到HEK293T中，24 h之后加入強力霉素（Dox）至2 μg/mL，72 h之后用于表達分析。

HeLa細胞利用電轉(zhuǎn)（BioRad Gene Pulser XL）轉(zhuǎn)染。4 μg PB?TRE?Cas9?NLS?IRES?hrGFP?Zeo、2 μg PB?CAG?rtTA和2 μg轉(zhuǎn)座酶載體被共電轉(zhuǎn)到2×106個HeLa細胞中，48 h之后，加入100 μg/mL Zeocin篩選3 代，然后用于單克隆的生長和挑選。對于挑出來的穩(wěn)定表達可誘導(dǎo)Cas9 的細胞株，電轉(zhuǎn)2 μg sgRNA 表達載體，24 h 后加入Dox（2 μg/mL）和嘌呤霉素（1 μg/mL），72 h后收集細胞并提取DNA。

HeLa8E 克隆細胞經(jīng)擴增后加入Dox，以誘導(dǎo)Cas9 的表達和對目標(biāo)基因的編輯。分別加入0.3、0.9、1.5 μg/mL 順鉑處理細胞48 h，在對照細胞（未加Dox）全部死亡之后，撤掉順鉑。由于0.3 μg/mL的順鉑不能使對照細胞全部死亡，后續(xù)實驗從0.9 μg/mL和1.5 μg/mL兩組中挑選單克隆進行。

1.2.3 免疫熒光染色

HEK293T 細胞培養(yǎng)在包被了多聚賴氨酸的蓋玻片上，轉(zhuǎn)染72 h之后，細胞直接用于拍照，或者用4%的PFA（paraformaldehyde）室溫固定15 min，PBS洗2 次，用含0.2%Triton 100 的PBS 處理5 min 以增加細胞膜的滲透性，然后用標(biāo)準(zhǔn)羊血清（武漢博士德公司）室溫封閉30 min。用加抗?Flag M2（Sigma公司，美國）的封閉液室溫孵育2 h。PBS 洗2 次后，將cy3?conjugated?goat?抗?mouse IgG（Jackson Immuno?Research 公司，美國）二抗和Hoechst 33258（Sigma公司，美國）加入PBS，并室溫孵育細胞1 h，PBS 洗3 次后用Vectashield Mounting medium（Vector Laborato?ries 公司，日本）進行封片。所有免疫熒光圖片用Olympus Flueview 1000 激光共聚焦顯微鏡拍攝。

1.2.4 T7EN1切割檢測

收集的細胞用裂解液（10 μmol/L Tris?HCl，0.4 mol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1% SDS，100 μg/mL Proteinase K）在58 ℃水浴鍋中消化過夜，用酚氯仿抽提裂解物，然后用乙醇沉淀得到DNA。目的DNA片段通過PCR 從基因組中擴增出，PCR 產(chǎn)物用PCR cleanup kit（Axygen 公司，美國）純化，吸取200 ng 純化后的PCR 產(chǎn)物，在20 μL 的1×NEBuffer 2（NEB 公司，美國）體系中退火，退火程序為95 ℃5 min；95 ℃～85 ℃，每秒降低1 ℃；85 ℃～25 ℃，每秒降0.1 ℃；4 ℃保持。退火后的PCR 產(chǎn)物用0.5 μL T7EN1 在37 ℃水浴鍋中處理30 min，然后在2.5%的瓊脂糖凝膠中電泳。利用Image J 軟件對凝膠電泳圖片進行光密度定量分析，采用之前報道的公式計算切割效率［9］，公式如下：切割效率=。a、b代表被切割片段的光密度值，c 代表未被切割片段的光密度值，對于需要TA 克隆和測序的樣品，PCR產(chǎn)物克隆進T載體，挑取陽性克隆用M13?47通用引物測序。

PCR擴增引物hRAG1?For：5′?GTGAAAGCCAT?CACAGGGAGAC?3′，hRAG1?Rev：5′?AGAATGCCT?CCCAGCTCAAGC?3′，擴增產(chǎn)物大小為623 bp；hERb lib?testF：5′?CTTCCTCCTACAACTGCAGTCAA?3′，hERb lib?testR：5′?CGCAATCGTGCCATTATACT?CCA?3′，擴增產(chǎn)物大小為656 bp；hERRa lib?testF：5′?GCATTGAGCCTCTCTACATCAAG?3′，hERRa lib?tes?tR：5′?GGTACCCTGAACTCACTCACATC?3′，擴增產(chǎn)物大小為522 bp；hERRb lib?testF：5′?GACTTCCC?GATTTGTGTCCACAG?3′，hERRb lib?testR：5′?CT?GTCCAGTGCCAGAATGAGAAG?3′，擴增產(chǎn)物大小為609 bp；hERRg lib?testF：5′?CACTACAGGACAGAC?GCTTCATT?3′，hERRg lib?testR：5′?CTCGTTAGCT?TACACTGGCAGTA?3′，擴增產(chǎn)物大小為684 bp。

1.2.5 順鉑耐藥克隆sgRNA 序列測定和目標(biāo)基因驗證

順鉑耐藥克隆sgRNA 序列擴增引物為pGL3 to PLKO Cla1 For：5′?CTCGACGGTATCGATCACGAG?AC?3′，U6 array seq Rev?new：5′?CTGCCATTTGTCT?CGAGGTCGAG?3′，擴增產(chǎn)物大小為549 bp，利用pGL3 to PLKO Cla1 For引物進行測序。VDR基因編輯位點擴增引物為hVDR lib?testF：5′?GCTGAAG?CAGGAGGATTACTTGA?3′，hVDR lib?testR：5′?GA?CACCAACACACAGATCCTCAA?3′，擴增產(chǎn)物大小為717 bp，利用hVDR lib?testF引物進行測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，使用Tukey 檢驗進行兩組比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 可誘導(dǎo)表達Cas9載體的構(gòu)建和驗證

來自不同實驗室的Cas9 載體各不相同，有的NLS放置在Cas9的一端［10-11］，有的放置在兩端［9］，有的利用了不同的NLS 序列［9，11］，密碼子優(yōu)化的規(guī)則也各不相同［9-12］。我們將不同版本的Cas9 和PGL3?U6?Rag1?sgRNA轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，利用T7EN1酶切來檢測不同版本Cas9 的切割效率。結(jié)果顯示，NLS?Flag?Cas9?NLS 和Cas9?NLS 具有相對較高的切割效率，光密度定量分析也得出一致的結(jié)果，但不同Cas9版本之間的切割效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A、B）。我們選擇NLS?Flag?Cas9?NLS 和Cas9?NLS這2 個版本的Cas9 進行PiggyBac 轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建，通過連接IRES?hrGFP 來指示Cas9 的表達情況，通過連接BleoR 抗性基因，利用Zeocin 藥篩來獲得穩(wěn)定插入Cas9 的細胞（圖1C）。在瞬時共轉(zhuǎn)染PB?TRE?NLS?Flag?Cas9?NLS 和PB?CAG?rtTA 的HEK293T 細胞中加入Dox，可以成功誘導(dǎo)hrGFP 的表達，而未加入Dox 的對照組中未見陽性信號（圖1D）。為了進一步檢測Cas9是否表達，我們利用an?ti?Flag抗體進行染色，結(jié)果顯示GFP陽性的細胞，同時也是Flag 陽性的，并且Flag 信號定位在細胞核中（圖1E），說明Cas9 蛋白成功表達和定位。有趣的是，F(xiàn)lag 染色結(jié)果顯示Cas9 蛋白在核仁中富集，這和之前報道的現(xiàn)象一致［7］，最近的研究表明，Cas9含有核仁定位信號，突變核仁定位信號會導(dǎo)致Cas9蛋白均勻分布在細胞核中，但是其切割效率也會隨之降低［13］。

圖1 可誘導(dǎo)表達Cas9載體的構(gòu)建和驗證Figure 1 Construction and verification of inducible Cas9 expression vector

2.2 可誘導(dǎo)表達Cas9的穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建和驗證

為了提高轉(zhuǎn)座效率，我們使用插入片段較小的PB?TRE?Cas9?NLS?IRES?hrGFP?Zeo 載體構(gòu)建可誘導(dǎo)表達Cas9 的穩(wěn)定細胞系。PiggyBac 轉(zhuǎn)座子載體、PB?CAG?rtTA 和轉(zhuǎn)座酶載體共電轉(zhuǎn)，加入Zeocin 傳代3次之后，挑選圓形的單克隆接種到96孔細胞板中繼續(xù)培養(yǎng)，加入Dox 之后，在熒光顯微鏡下挑選GFP 陽性的克隆，共挑出7 個GFP 信號較強的克?。?A、1G、2B、3G、5H、8E、10A）繼續(xù)培養(yǎng)（圖2A）。為了挑選效率最高的細胞系，我們在這7 個細胞株中電轉(zhuǎn)了PGL3?U6?Rag1?sgRNA，PCR擴增目的片段并進行T7EN1酶切，結(jié)果顯示8E克隆具有較高的切割效果（圖2A）。為了進一步檢測切割效率，我們將PCR 產(chǎn)物進行了TA 克隆并測序，在17 個成功測序克隆中檢測到15 個克隆含有突變，效率高達88.2%（15/17），其中76.5%（13/17）的克隆發(fā)生了堿基缺失，11.8%（2/17）的克隆同時發(fā)生了缺失和插入（圖2B），這些結(jié)果說明我們成功構(gòu)建了可誘導(dǎo)表達Cas9的穩(wěn)定細胞系。

圖2 可誘導(dǎo)表達Cas9的穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建和驗證Figure 2 Generation and verification of a stable HeLa cell line with inducible expression of Cas9

為了檢測HeLa 8E細胞株在其他基因位點的基因編輯效果，我們針對人ERb、ERRa、ERRb和ERRg 4 個基因設(shè)計相應(yīng)的sgRNA，并檢測切割效率。傳統(tǒng)的sgRNA 表達載體構(gòu)建依賴oligo 的退火然后連接到載體中，無法進行sgRNA表達載體的高通量構(gòu)建，為了能在HeLa 8E細胞上進行高通量篩選，我們將sgRNA識別序列設(shè)計在前向引物上，以sgRNA的骨架為模板，和公共后向引物擴增出攜帶完整sgRNA 序列的片段，利用二類限制性內(nèi)切酶Esp3Ⅰ和T4 DNA連接酶，通過邊切邊連的方式，可以高通量地構(gòu)建sgRNA 表達載體（圖2C）。我們利用這種方法一次性構(gòu)建了8 條sgRNA 表達載體，針對每個基因，等質(zhì)量混合2 條sgRNA 載體，并電轉(zhuǎn)HeLa 8E細胞系，PCR 擴增結(jié)果顯示每個基因都出現(xiàn)了明顯的片段缺失（圖2D）。以上結(jié)果證明我們構(gòu)建的可誘導(dǎo)表達Cas9 的穩(wěn)定細胞系沒有編輯位點的偏好性，可以在多個基因位點進行高效基因編輯，為下一步用于高通量sgRNA文庫篩選打下了很好的基礎(chǔ)。

2.3 順鉑耐藥性核受體基因的篩選

順鉑是一種含鉑的抗癌藥物，對惡性上皮腫瘤、淋巴瘤等都有治療功效，長期使用這種藥物會導(dǎo)致人體產(chǎn)生耐藥性，但是耐藥機制仍存在爭議［1］。核受體超家族是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，共含有48個基因，在細胞分化、增殖和代謝中發(fā)揮不同作用，參與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展［14］。核受體是重要的藥物靶點，阻斷乳腺癌患者雌激素受體（ERa）作用的藥物或阻斷前列腺癌患者雄激素受體（AR）作用的藥物顯著改善了患者的生存，但也伴隨著嚴(yán)重的藥物耐藥性［14］。為了探究核受體超家族成員是否參與順鉑耐藥性的發(fā)生，我們針對目前鑒定的47個人類核受體基因（由于HeLa 細胞不表達ERa［15］，所以排除此基因），設(shè)計了94 條sgRNA，組成了一個小型的sgRNA 文庫（圖3A），包裝成病毒顆粒之后感染HeLa 8E 細胞，利用嘌呤霉素篩選整合進sgRNA 載體的細胞。在開始順鉑耐藥性實驗前48 h，加入Dox以誘導(dǎo)Cas9的表達和對目標(biāo)基因的編輯。我們設(shè)計了3 個順鉑濃度梯度，在對照細胞全部死亡之后，撤掉順鉑。從0.9 μg/mL 和1.5 μg/mL 兩組中共長出37 個單克隆（圖3B），挑選每個單克隆并擴增培養(yǎng)，提取基因組DNA之后PCR擴增包含sgRNA的序列，Sanger 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)21 個克隆含有維生素D受體（vitamin D3 receptor，VDR）sgRNA，2 個克隆含有維甲酸受體β（retinoic acid receptor beta，RARb）sgRNA，含有視黃醇X 受體（retinoid x receptor beta，RXRb）和類固醇生成因子?1（nuclear receptor 5A1，NR5A1）sgRNA 各有1 個克?。▓D3C），剩下12 個克隆sgRNA 位點顯示亂峰，無法確定具體是哪個sgRNA。為了進一步驗證目標(biāo)基因是否被編輯，我們對21個含有VDR sgRNA單克隆的VDR區(qū)域進行了測序，結(jié)果顯示20個克隆的sgRNA識別區(qū)域發(fā)生了突變（圖3D）。

圖3 順鉑耐藥性核受體基因的篩選Figure 3 Screening of cisplatin?resistant nuclear receptor genes

3 討論

本研究利用PiggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，成功構(gòu)建了可誘導(dǎo)表達Cas9 的穩(wěn)定HeLa 細胞系，并證明在多個位點可以高效切割基因組。同時，我們針對人核受體基因構(gòu)建了sgRNA文庫，在這個細胞系上進行了順鉑耐藥性的篩選。之前有研究表明，PiggyBac轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶存在的情況下會發(fā)生再轉(zhuǎn)座或者丟失的現(xiàn)象［16］，為了防止這種情況的出現(xiàn)，我們轉(zhuǎn)座酶是瞬時表達的，不會持續(xù)性存在；同時，在培養(yǎng)HeLa 8E 細胞株的過程中，也會定期加上Zeocin 進行藥篩，以排除Cas9丟失和被沉默的可能。除了通過誘導(dǎo)控制Cas9 的表達，Cas9 切口酶/雙sgRNA［7］、截短sgRNA［17］、高保真Cas9 突變體［18-23］等策略也用于降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)。另外，多個比sp?Cas9小的同系物如saCas9［24］、Cpf1［25］等也被發(fā)現(xiàn)，一定程度上解決了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的問題。關(guān)于Cas9 在核仁中富集，之前的研究表明，一旦表達sgRNA，Cas9 會均勻分布在細胞核中［7］，這種現(xiàn)象是很難用Cas9 含有核仁定位信號來解釋的［13］，可能是由于Cas9/sgRNA復(fù)合體的溶解性更好，亦有可能是其他機制導(dǎo)致，值得進一步的研究。

之前有文章報道核受體基因ERb 的激動劑可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細胞瘤細胞對順鉑的敏感性［14］，鼓勵我們?nèi)ヌ骄亢耸荏w超家族成員與順鉑耐藥性的關(guān)系。在篩選的過程中，由于含有RARb、RXRb 和NR5A1 sgRNA的克隆較少，我們沒有進一步去驗證對應(yīng)的基因是否被編輯，以及有12個克隆含有多個sgRNA，也沒有進一步去驗證具體是哪些基因被編輯，這些都值得繼續(xù)探索。20 個含有VDR sgRNA克隆的測序結(jié)果顯示，所有單克隆都攜帶相同的突變，提示這20 個單克隆可能來源于同一個細胞，之前有文章報道維生素D3及其受體VDR調(diào)控機體的鈣磷代謝穩(wěn)態(tài)，對多種腫瘤細胞的增殖有抑制作用。因此，突變VDR 可能會使HeLa 8E細胞的增殖加快，導(dǎo)致長出的克隆大部分含有VDR突變，當(dāng)然，這也可能是順鉑耐藥性發(fā)生的原因，需要進一步通過直接敲除或者過表達VDR進行正反驗證，具體的機制也值得我們深入去解析。