詹 峰，蔣 超，張 楷，龔偉達(dá)，王 荇，張 云

江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院肝膽腹腔鏡外科，江蘇 無(wú)錫 214200

肝臟缺血再灌注（ischemia?reperfusion，IR）損傷是肝部分切除術(shù)和肝移植術(shù)后常見的并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。該過程涉及到活性氧的釋放，炎癥細(xì)胞的激活，炎性介質(zhì)的產(chǎn)生等諸多因素［1］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反應(yīng)能加重炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致肝臟缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一［2］。STF?083010 是肌醇依賴酶1（inositol?requiring enzyme 1，IRE1）核糖核酸酶特定抑制劑，可特異性阻斷IRE1?剪切型X?盒結(jié)合蛋白1（spliced X?box binding protein 1，sXBP1）信號(hào)通路，有效降低sXBP1 的表達(dá)［3］。本研究旨在探討STF?083010 預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

30 只健康雄性C57BL/6 小鼠，6～8 周齡，體重15～20 g，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無(wú)特殊病原體（SPF）環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。STF?083010（Selleck 公司，美國(guó)）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測(cè)試劑盒（北京達(dá)科為）；TRIzol（南京諾唯贊）、腫瘤壞死因子（tu?mor necrosis factor，TNF）?α、白細(xì)胞介素（interleu?kin，IL）?6和IL?1β引物（Invitrogen公司，英國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；ChamQ 通用型SYBR Green qPCR Master Mix（南京諾唯贊）；TUNEL染色試劑盒（武漢賽維爾）；RIPA 裂解液（上海碧云天）；sXBP?1抗體（Proteintech公司，美國(guó)）、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP 同源蛋白（C/EBP?homologous protein，CHOP）抗體、GAPDH 抗體、兔源性二抗（CST 公司，美國(guó)）；超敏ECL發(fā)光液（蘇州新賽美）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型

將30只小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只。①假手術(shù)組（sham組）：小鼠僅接受腹腔麻醉和開、關(guān)腹操作；②肝缺血再灌注組（IR組）：小鼠在建立IR 前30 min，按30 mg/kg 腹腔注射生理鹽水；③STF?083010 預(yù)處理+肝缺血再灌注組（IR+STF?083010組）：小鼠在建立IR 前30 min，按30 mg/kg 腹腔注射STF?083010。

肝臟缺血再灌注模型建立具體步驟：小鼠術(shù)前12 h禁食，不禁飲，5%水合氯醛腹腔注射，麻醉成功后，取小鼠腹部正中切口，用生理鹽水棉簽明確分離肝左、中葉后，使用無(wú)損傷血管夾夾閉通往肝左葉和肝中葉的肝蒂，此時(shí)可見缺血肝葉色澤改變，關(guān)腹。90 min 后，松開血管夾，缺血肝葉恢復(fù)血供，肝臟顏色轉(zhuǎn)紅，關(guān)腹。6 h 后處死小鼠，收取靜脈血和肝臟組織，部分組織用4%甲醛固定，其余肝臟樣本生理鹽水沖洗后，液氮保存。

1.2.2 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

采用TRIzol 法提取組織和細(xì)胞RNA，并測(cè)定RNA 的濃度及純度（NanoDrop 公司，美國(guó)）。首先按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)使用SYBR qPCR Master Mix 試劑，并在ABI 7900 Fast Real?Time PCR system上進(jìn)行。按照2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 蛋白提取及Western blot

提取總蛋白時(shí)，使用含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞。測(cè)定濃度后，按比例加入5×上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min。蛋白經(jīng)SDS?PAGE 電泳分離后，將相應(yīng)分子量的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，然后在室溫下用快速封閉液封閉10 min；分別加入一抗4 ℃孵育過夜，室溫下二抗孵育2 h，TBST 洗膜后使用超敏ECL 曝光液成像分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 肝功能檢測(cè)

取小鼠靜脈血，3 000 r/min 離心10 min，收集上清。根據(jù)試劑盒說明測(cè)定血清ALT和AST水平。

1.2.5 肝臟組織病理學(xué)檢查

取10%福爾馬林溶液固定的肝組織，常規(guī)切片后，HE 染色，于光鏡下觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞水腫及壞死的情況。

1.2.6 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況

根據(jù)TUNEL染色試劑盒說明操作，具體步驟為：用免疫染色固定液4%多聚甲醛固定細(xì)胞30～60 min；PBS洗滌2次，每次10 min；加入免疫染色強(qiáng)力通透液室溫孵育5 min；PBS洗滌2次，每次10 min；在樣品上加50 μL TUNEL 檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min；PBS洗滌3次；用抗熒光淬滅封片液封片后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad7.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間差異采用方差分析，組間差異兩兩比較采用SNK 法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清轉(zhuǎn)氨酶水平變化

收取小鼠靜脈血，測(cè)定各組小鼠血清ALT、AST水平。與sham組相比，IR組小鼠肝酶明顯升高（P＜0.01，圖1）；與IR組小鼠相比，IR+STF?083010預(yù)處理組小鼠血清ALT、AST水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 STF?083010 預(yù)處理對(duì)缺血再灌注小鼠ALT 和AST的影響Figure 1 Effects of STF?083010 on ALT and AST in mice with liver ischemia/reperfusion injury

2.2 各組肝臟組織學(xué)改變

灌注6 h 后，收取小鼠肝臟標(biāo)本行HE 染色。sham組小鼠肝臟組織排列正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞成條索狀排列，無(wú)肝細(xì)胞壞死；IR組肝細(xì)胞排列紊亂，水腫明顯，并可見大片肝細(xì)胞壞死（圖2A）；而IR+STF?083010IR組肝細(xì)胞呈輕度水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，壞死肝細(xì)胞較IR組也明顯減少。同樣地，TUNEL染色也發(fā)現(xiàn)IR組肝細(xì)胞凋亡較sham組顯著增加，而STF?083010預(yù)處理能明顯減少肝細(xì)胞凋亡（圖2B）。表明STF?083010 預(yù)處理能有效減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷。

2.3 各組肝臟IL?6、TNF?α、IL?1β表達(dá)量的變化

與sham組相比，IR組小鼠IL?6、TNF?α、IL?1β mRNA 水平明顯升高（P＜0.01，圖3）；IR+STF?083010組肝臟IL?6、TNF?α、IL?1β mRNA的表達(dá)水平較缺血再灌注組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3）。

圖3 STF?083010預(yù)處理對(duì)缺血再灌注小鼠肝臟組織中IL?6、TNF?α、IL?1β水平的影響Figure 3 Effects of STF?083010 on the levels of IL?6，TNF?α，IL?1β in liver with ischemia/reperfusion injury

2.4 各組肝臟sXBP1蛋白表達(dá)水平的變化

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)sham組小鼠肝臟組織中僅有少量的sXBP1 蛋白表達(dá)，相比sham組，IR組中sXBP1蛋白的表達(dá)明顯升高（圖4A）；STF?083010預(yù)處理則能顯著降低缺血再灌注導(dǎo)致的sXBP1 和CHOP蛋白水平增高（圖4B）。

圖4 STF?083010預(yù)處理對(duì)缺血再灌注小鼠肝臟組織中sXBP1、CHOP蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effects of STF?083010 on the expression of sXBP1 and CHOP in liver with ischemia/reperfusion injury

3 討論

肝臟缺血再灌注損傷是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過程，缺血過程會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)酸中毒、鈣超載等；再灌注過程會(huì)導(dǎo)致活性氧釋放、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)而出現(xiàn)肝功能不全，是影響肝移植、肝切除手術(shù)預(yù)后效果的主要因素之一［4-5］。因此，探索預(yù)防或減輕肝臟缺血再灌注損傷的相關(guān)研究，具有重要的臨床意義。

近年來(lái)的研究表明，ERS 與IR 損傷密切相關(guān)，ERS 可通過激活經(jīng)典的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）抑制錯(cuò)誤蛋白質(zhì)翻譯和/或指導(dǎo)錯(cuò)誤蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊修飾，進(jìn)而減輕細(xì)胞應(yīng)激損傷。在應(yīng)激早期，細(xì)胞能迅速啟動(dòng)生存途徑，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，并維持其穩(wěn)態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到長(zhǎng)時(shí)間的刺激或刺激強(qiáng)度過大時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量錯(cuò)誤蛋白或未折疊蛋白超過了細(xì)胞生存途徑所能處理的范圍，將使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的穩(wěn)態(tài)遭到破壞，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)持續(xù)性應(yīng)激，激活CHOP等介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程序，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6-7］。

經(jīng)典的ERS 有3條信號(hào)通路，即蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR?like ER kinase，PERK）/真核翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor?2α，eIF2α）、IRE1/sXBP1、轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）。其中，IRE1?sXBP1 通路是ERS 中最為經(jīng)典和保守的通路［8］。IRE1 在決定細(xì)胞在ERS 狀態(tài)下應(yīng)對(duì)各種刺激的轉(zhuǎn)歸中扮演重要角色［9-10］。IRE1磷酸化活化后可激活其具有核酸內(nèi)切酶活性的RNase 結(jié)構(gòu)域，特異性地剪切XBP1 mRNA，促進(jìn)剪接形式的XBP1 蛋白即sXBP1表達(dá)。sXBP1 是強(qiáng)效轉(zhuǎn)錄因子，也是ERS 中重要的效應(yīng)分子，它能進(jìn)一步促進(jìn)下游信號(hào)分子CHOP等的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，加重炎癥損傷［11］。薛強(qiáng)等［12］研究發(fā)現(xiàn)使用短發(fā)夾RNA干擾XBP1能有效減輕肝移植時(shí)的缺血再灌注損傷。STF?083010 是一種新型IRE1?sXBP1 通路特異性抑制劑，在不影響IRE1 激酶活性的情況下，特異性抑制IRE1的核酸內(nèi)切酶活性，從而抑制XBP1 mRNA 剪接，降低sXBP1 蛋白表達(dá)［13］。最近研究顯示其在多種肝臟損傷中具有保護(hù)作用。Lebeaupin 等［14］報(bào)道STF?083010 可以緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝病，其機(jī)制與NOD樣受體家族核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NOD?like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體激活及細(xì)胞死亡相關(guān)。Chen等［15］研究顯示STF?083010改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷，并上調(diào)miR?122 表達(dá)，進(jìn)而緩解肝臟纖維化。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)STF?083010 可以通過阻斷IRE1?sXBP1 信號(hào)通路，激活自噬信號(hào)，減輕硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）引起的小鼠肝臟損傷［16］。徐璐等［17］的研究發(fā)現(xiàn)STF?083010 可以減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷，改善腎功能。然而，關(guān)于STF?083010 在肝臟缺血再灌注中作用的研究尚未見報(bào)道，本研究結(jié)果顯示STF?083010能顯著降低小鼠缺血再灌注肝臟組織中sXBP1、CHOP 蛋白的表達(dá)，抑制ERS相關(guān)炎癥和凋亡通路，對(duì)小鼠肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，本研究顯示STF?083010對(duì)小鼠肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制ERS 相關(guān)凋亡通路有關(guān)。提示STF?083010 有可能在肝臟外科的臨床中有其應(yīng)用價(jià)值，有望為肝缺血再灌注損傷的防治提供一個(gè)新的干預(yù)靶點(diǎn)。