劉 靜，孔祥清

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南京 210029

鈣化性主動脈瓣膜疾?。╟alcific aortic valve dis?ease，CAVD）是一種常見的心臟疾病。在65歲以上的成年人中，CAVD 導致心血管疾病的死亡率增加了大約30%；在75 歲以上的成年人中，死亡率增加了40%～50%［1-2］。該疾病的發(fā)展被認為是由內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)沉積、炎性細胞浸潤、細胞外基質(zhì)（extracel?lular matrix，ECM）沉積和瓣膜新血管形成引起的，從而促進成骨和鈣化［3］。迄今為止，尚無有效的藥物可以治療或者延緩CAVD的進展。華法林是維生素K 的拮抗劑，一直是抗凝治療的主要藥物［4］。華法林一方面通過抑制肝臟中的維生素K環(huán)氧還原酶發(fā)揮抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的合成，從而起到抗凝血的作用；另一方面，華法林還可以抑制維生素K 依賴蛋白基質(zhì)Gla 蛋白（matrix Gla protein，MGP）的羧基化。羧基化MGP通過直接抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）2 和BMP4 的形成來防止鈣化，是組織細胞鈣化的重要抑制因子［5-6］。我們的前期研究已證實，治療水平10 μmol/L的華法林和1.6 mmol/L的無機磷酸鹽（Pi）可導致主動脈瓣間質(zhì)細胞（aortic valve interstitial cell，AVIC）的鈣化［7-8］。

大量的動物實驗和臨床研究表明，銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，EGB761）對心血管疾病具有保護作用，包括抗氧化清除超氧化物、自由基和一氧化氮（nitric oxide，NO），抗血小板，減輕炎癥和動脈粥樣硬化斑塊形成，調(diào)節(jié)包括NO和內(nèi)皮素（en?dothelin，ET）在內(nèi)的血管活性物質(zhì)的合成，從而保護血管［8］。最近有研究表明，EGB761可顯著減少β?甘油磷酸鈉誘導的大鼠主動脈血管平滑肌細胞內(nèi)鈣的沉積，從而減輕血管鈣化［10-11］，但尚不清楚EGB761是否可以減輕AVIC鈣化。

因此，本研究主要在豬AVIC培養(yǎng)的基礎上，以治療水平10 μmol/L 的華法林和1.6 mmol/L Pi誘導鈣化模型，觀察EGB761對豬AVIC鈣化及成骨分化的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

3 月齡實驗用豬，雌性，體重20～30 kg，美國密西根州立大學動物實驗中心提供。所有與動物有關的工作都得到了美國密歇根州立大學實驗動物倫理委員會的批準。高糖DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國）；華法林鈉（Sigma?Aldrich 公司，美國）；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白?2（human recombinant BMP2，rhBMP2，廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；茜素紅（Sig?ma?Aldrich 公司，美國）；CCK?8 試劑盒（Dojindo 公司，日本）；鈣離子檢測試劑盒（CA590，Randox公司，英國）；BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisher 公司，美國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測試劑盒（Bioassay Systems 公司，美國）；Msx2抗體、pSmad1/5 抗體（Abcam 公司，美國）；Runx2 抗體、BMP2 抗體、GAPDH 抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；Alex Fluro700 熒光標記二抗（Thermo?Fisher 公司，美國）；ABI QuantStudio 7 Flex Real?Time PCR System（Applied Biosystems 公司，美國）；Odyssey?CLX imaging system（Li?cor Biosciences 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 豬AVIC的分離和培養(yǎng)

取心臟放入含5%雙抗的預冷PBS 溶液。沿主動脈瓣環(huán)自根部約20%處將主動脈瓣3個瓣葉從根部剪下，放入預冷PBS 中反復漂洗。將剪碎的主動脈瓣置入膠原酶Ⅱ消化液，37 ℃水浴攪拌消化10～15 min，收集上清，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，1 500 r/min 離心，去上清，加入高糖DMEM 培養(yǎng)液混懸沉淀；混勻液用一次性無菌細胞篩過濾后轉(zhuǎn)入T25 細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；48 h后觀察細胞貼壁情況并進行首次細胞換液；72 h 后，細胞生長密度達到80%融合時進行細胞傳代，即為原代培養(yǎng)的第1 代。傳代后取第3～5 代的細胞用于本實驗的后續(xù)研究。

1.2.2 華法林誘導豬AVIC 鈣化模型的構(gòu)建及EGB761干預

高糖DMEM 培養(yǎng)基中加入1%的胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗、1.6 mmol/L Pi 以及10 μmol/L 華法林，4 ℃，避光保存待用。細胞貼壁融合達到80%時，用華法林鈣化培養(yǎng)基處理AVIC，設為華法林處理組。EGB761干預組在華法林誘導鈣化培養(yǎng)基中同時加入不同濃度的EGB761，共同孵育培養(yǎng)4～7 d。為了進一步驗證EGB761 抑制瓣膜間質(zhì)細胞成骨樣分化的機制，設立rhBMP2 干預組，將100 ng/mL rhBMP2［12］同時加入到華法林誘導鈣化培養(yǎng)基和EGB761中，共同孵育培養(yǎng)AVIC 4～7 d。

1.2.3 細胞活性檢測

將AVIC 以8×103個/100 μL 接種于96 孔板中，待細胞達到80%融合時吸去完全培養(yǎng)基；細胞分為正常對照組、華法林處理組、不同濃度EGB761干預組（華法林誘導鈣化培養(yǎng)基+0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL EGB761），給予不同的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育細胞4～7 d。按照CCK?8 試劑盒說明，向每孔加入10 μL CCK?8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.2.4 茜素紅染色

棄去培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 次；4%甲醛溶液固定細胞10 min，PBS 清洗3 次；95%乙醇室溫固定細胞20～30 min后，去離子水漂洗3遍；2%茜素紅染色1 min，鏡下觀察到橘紅色結(jié)節(jié)即終止染色，最長染色時間不超過5 min；2%茜素紅的配制方法參照Gao等［7-8］的方法；去離子水洗凈非特異性染色，鏡下拍照。

1.2.5 細胞鈣濃度測定

將12 孔板中培養(yǎng)的細胞用PBS 清洗3 次，每孔加入0.6 mol/L HCl 150 μL，4 ℃搖床24 h 脫鈣處理。收集上清液，使用鈣離子檢測試劑盒測定鈣濃度。每個樣品取5 μL 加入96 孔板，加入200 μL 工作液，室溫振蕩5 min混合均勻，讀取570 nm處吸光度。分別測量標準品及樣品在570 nm處吸光值（A標、A樣）；繼續(xù)加入EDTA，在樣品變?yōu)闊o色時立即再次讀取吸光值，得到A樣/EDTA；計算細胞內(nèi)絕對鈣濃度（mg/dL）=（A標-A樣/EDTA）/A標。將12 孔板中液體吸凈棄上清，預冷的PBS 沖洗細胞；每孔加入100 μL 0.1 mol/L NaOH/0.1% SDS 裂解細胞，裂解液4 ℃13 000g離心20 min，取上清使用BCA 法測蛋白濃度。標準化鈣濃度（μg/mg 蛋白）=絕對鈣濃度/蛋白濃度。

1.2.6 細胞ALP活性檢測

將12孔板中培養(yǎng)液吸凈，用預冷的PBS清洗；各孔添加200 μL 0.05%的Triton X?100，反復凍融3次。收集每孔中液體，4 ℃15 000 r/min離心15 min，取上清液作為待測樣品。使用ALP活性檢測試劑盒，向96孔板內(nèi)添加20 μL待測樣品和180 μL工作液，工作液按每200 μL 分析緩沖液加入5 μL 醋酸鎂和2 μL pNPP底物緩沖液的比例進行配制，輕輕震蕩混勻。讀取t0（0 min）和t（4 min）時波長405 nm 處的吸光值：ODt0、ODt及對照OD校準和OD水。根據(jù)公式計算待測樣品的ALP活性（U/L）=［（ODt-ODt0）×200］/［（OD標準-OD水）×200×4］×35.3。標準化細胞內(nèi)ALP活性（U/mg蛋白）=細胞內(nèi)絕對ALP活性/蛋白濃度。

1.2.7 Real?time PCR

Runx2、Msx2 以及BMP2 引物設計合成由美國IDT 公司 完成。Runx2 上游引物5′?GGACGAG?GCAAGAGTTTCAC?3′，下游引物5′?GTGGATTA?AAAGGACTTGGTGC?3′；Msx2上游引物5′?CTGGT?GAAGCCCTTCGAGAC?3′，下游引物5′?AGGGCT?CATATGTCTTGGCG?3′；BMP2 上游引物5′?GGAGC?TAGCACTGAGCGAC?3′，下游引物5′?CGAAGT?GAGGAGCCCAAGTT?3′）；GAPDH 上游引物5′?GTCGGAGTGAACGGATTTGGC?3′，下游引物5′?CTTGCCGTGGGTGGAATCAT?3′。根據(jù)CellAmpTMDirect TB GreenTMRT?qPCR Kit（TaKaRa 公司，日本）說明書直接進行逆轉(zhuǎn)錄。使用QuantStudio 7 Flex Real?Time PCR儀進行實時熒光定量PCR。所有熒光定量PCR反應均重復3次，目標基因標準化于管家基因GAPDH。采用2-ΔΔCt計算目的基因表達的相對值。

1.2.8 Western blot檢測相關蛋白表達

使用NE?PER 核蛋白?胞漿蛋白專用抽提試劑盒（Thermo公司，美國）按照說明書提取蛋白。提取的蛋白用10%～15%SDS?PAGE 電泳，上樣量50 μg，半干轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉溶液的TBST緩沖液封閉，一抗（BMP2、Runx2、Msx2、pSmad1/5）4 ℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育1 h，全程避光直接用Odyssey?CLX imaging system（Li?cor Biosciences 公司，美國）進行掃描。對掃描結(jié)果進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

通過SPSS 23.0 軟件進行分析，統(tǒng)計圖通過Graphpad Prism 6.0 軟件作圖。所有計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），Bonferroni法進行多重比較檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EGB761對AVIC活性的影響

與正常對照組相比，0.1 mg/mL 和0.3 mg/mL EGB761 干預組AVIC 的活性無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05），而0.5 mg/mL 和0.7 mg/mL EGB761 干預組與正常對照組相比，AVIC 活性均明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示高濃度的EGB761可能具備致細胞毒性作用（圖1）。因此，本文選擇0.1 mg/mL 和0.3 mg/mL 兩種濃度的EGB761 進行后續(xù)研究。

圖1 不同濃度的EGB761與華法林對AVIC活性的影響Figure 1 The effect of EGB761 on AVIC viability under warfarin treatment

2.2 EGB761對華法林誘導AVIC鈣化的作用

茜素紅染色結(jié)果顯示，與正常對照組相比，華法林處理組可見明顯的橘紅色礦化結(jié)節(jié)，給予0.3 mg/mL 的EGB761干預處理后，橘紅色礦化結(jié)節(jié)明顯減少，而給予0.1 mg/mL EGB761 干預處理后，橘紅色礦化結(jié)節(jié)未見明顯減少（圖2A）。細胞內(nèi)鈣含量測定結(jié)果顯示，華法林處理組細胞內(nèi)鈣含量較正常對照組顯著升高（P<0.05）。給予0.3 mg/mL EGB761干預處理后顯著降低了細胞內(nèi)鈣含量（P<0.05），而0.1 mg/mL EGB761 干預處理后，細胞內(nèi)鈣含量相比較華法林處理組未見明顯差異（P＞0.05，圖2B）。ALP 活性檢測結(jié)果進一步顯示，華法林顯著增加了ALP 活性，0.3 mg/mL EGB761 干預處理組與華法林處理組相比，細胞內(nèi)ALP 活性顯著降低（P<0.05），而0.1 mg/mL EGB761處理組與華法林處理組相比，細胞內(nèi)ALP 活性沒有明顯影響（P＞0.05，圖2C）。上述結(jié)果提示，0.3 mg/mL EGB761 可以減輕華法林誘導的AVIC 鈣沉積，從而顯著抑制了AVIC 的鈣化。后續(xù)選擇0.3 mg/mL EGB761進行成骨分化機制的研究。

圖2 EGB761對AVIC鈣化的抑制作用Figure 2 The inhibition of EGB761 on calcification in AVIC

2.3 EGB761抑制華法林誘導AVIC的成骨分化

Real?time PCR和Western blot結(jié)果顯示，華法林誘導AVIC成骨樣分化標志蛋白Runx2、Msx2、BMP2的表達均明顯增加（P<0.05），給予0.3 mg/mL EGB761 處理細胞后，Runx2、Msx2、BMP2 的表達均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果表明，EGB761 抑制了AVIC內(nèi)成骨分化蛋白Runx2、Msx2 和BMP2 的激活，從而發(fā)揮了抗成骨分化的保護作用（圖3）。

圖3 EGB761對AVIC成骨分化的抑制作用Figure 3 The inhibition of EGB761 on osteogenesis differentiation in AVIC

2.4 EGB761 通過BMP2/Smad1/5/Runx2 通路抑制AVIC成骨樣分化

將100 ng/mL rhBMP2 與EGB761 共同孵育pAVIC。茜素紅染色、細胞內(nèi)鈣含量及ALP 活性檢測結(jié)果顯示，EGB761 顯著降低了華法林誘導AVIC的鈣沉積、鈣含量及ALP 活性，而這一作用可以被rhBMP2 顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05，圖4A～C）。Real?time PCR 結(jié)果顯示，rhBMP2 上調(diào)了EGB761 抑制的Runx2 和Msx2 mRNA 表達（P<0.05，圖4D、E）。Western blot 結(jié)果顯示，rhBMP2 顯著增加了被EGB761 抑制的Runx2 以及磷酸化Smad1/5 蛋白的表達水平（P<0.05，圖4F）。結(jié)果表明，EGB761 可能通過抑制磷酸化Smad1/5，抑制Runx2 的表達上調(diào)，從而發(fā)揮抑制AVIC成骨樣分化的作用。

圖4 EGB761通過BMP2/Smad1/5/Runx2通路抑制鈣化和成骨分化Figure 4 EGB761 blocks calcification and osteogenesis differentiation by inhibition BMP2/Smad1/5/Runx2 signaling path?way

3 討論

CAVD 涉及到主動脈瓣瓣葉進行性增厚、基質(zhì)重塑以及鈣鹽沉積，從而導致瓣葉嚴重鈣化、結(jié)構(gòu)功能減退，最終發(fā)生瓣膜嚴重的狹窄和/或關閉不全［2］。隨著研究的深入，CAVD 不再被認為是一個被動的、隨著年齡的增長和鈣沉積，瓣膜進行性退化的過程，而是一種“主動調(diào)控”的進行性疾病［13］。CAVD的發(fā)展過程包括慢性炎癥、脂蛋白沉積、腎素?血管緊張素系統(tǒng)參與以及細胞外基質(zhì)重塑，激活特定的成骨分化信號通路，參與瓣膜間質(zhì)細胞從成纖維細胞/肌成纖維細胞轉(zhuǎn)向成骨樣細胞表型和細胞凋亡［14］。瓣膜間質(zhì)細胞是主動脈瓣膜的主要細胞類型，在CAVD進展中起主要作用，它是目前探討瓣膜鈣化發(fā)生發(fā)展機制的主要方向［3］，多項研究確定了瓣膜間質(zhì)細胞具有成骨分化和鈣化的能力［15］。

現(xiàn)有的研究證實多條信號通路均參與瓣膜鈣化的病理過程，如BMP2/Smad1/5/8、NF?κB?RANKL、Wnt?β?catenin和p38?MAPK通路等［12］。眾多學者對成骨因子BMP2/Smads/Runx2 信號轉(zhuǎn)導通路進行了深入的研究。BMP2 通過結(jié)合靶細胞表面2 種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體（BMPR?Ⅰ，BMPR?Ⅱ）向胞內(nèi)傳遞信號。首先BMP2 與細胞膜上BMPR?Ⅱ結(jié)合后，BMPR?Ⅰ能夠特異性與此二聚體結(jié)合而發(fā)生自身磷酸。磷酸化的BMPR?Ⅰ再依次通過激活下游的一系列細胞內(nèi)底物信號蛋白，這些蛋白統(tǒng)稱為受體調(diào)節(jié) 的Smads（R?Smads），包 括Smad1、Smad5 和Smad8。被磷酸化激活的Smad1 或Smad5 與Co?Smads（Smad4）結(jié)合形成復合物后由胞漿進行核轉(zhuǎn)位進入細胞核，調(diào)節(jié)各種靶基因的轉(zhuǎn)錄包括Runx2和Msx2等，共同參與各種成骨細胞表型基因表達和分化［16］。用外源的BMP2，如rhBMP2，可以啟動該信號通路，激活Smads 復合物，在特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2的參與下調(diào)節(jié)下游靶基因的表達。

EGB761 是一種標準化的提取物，含有24%的黃酮糖苷和6%的萜烯內(nèi)酯，如銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和白果內(nèi)酯。類黃酮具有清除自由基的作用，而萜烯內(nèi)酯則保護線粒體膜免受自由基的破壞［17］。研究報道，EGB761 可以穩(wěn)定由于過量線粒體氧自由基和過氧亞硝酸鹽引起的線粒體膜電位的變化，并有助于防止離子穩(wěn)態(tài)的破壞，起到抗氧化的作用。此外，還有學者發(fā)現(xiàn)，EGB761可以顯著降低β?甘油磷酸誘導的大鼠主動脈平滑肌細胞鈣沉積，還抑制成骨分化，這可能與減少ALP的表達有關；此外，它還下調(diào)NF?κB活性，并減少血管平滑肌細胞氧自由基的產(chǎn)生，有潛力作為臨床上預防和治療血管鈣化的一種手段［10-11］。

本研究使用國際上認可的體外誘導瓣膜間質(zhì)細胞鈣化模型［7］，即治療水平（10 μmol/L）的華法林聯(lián)合低劑量的Pi處理瓣膜間質(zhì)細胞，在此基礎上給予EGB761共同干預處理鈣化的瓣膜間質(zhì)細胞。本研究結(jié)果提示，EGB761 可以明顯抑制華法林誘導的瓣膜間質(zhì)細胞的鈣含量，下調(diào)ALP 活性，從而減少細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)形成。Real?time PCR 和Western blot的結(jié)果均進一步提示，EGB761抑制了華法林誘導的瓣膜間質(zhì)細胞成骨分化，Runx2、Msx2 以及BMP2的mRNA 表達和蛋白表達量均顯著降低。給予rhBMP2 進一步驗證了上述結(jié)果，EGB761 降低了華法林誘導瓣膜間質(zhì)細胞的鈣沉積、鈣含量及ALP活性，下調(diào)了參與瓣膜間質(zhì)細胞成骨分化的基因表達，這一作用可以被rhBMP2 顯著逆轉(zhuǎn)。Western blot 結(jié)果進一步證實了EGB761 抑制了Smad1/5 磷酸化及Runx2 的表達上調(diào)，可能與抑制了BMP2/Smad1/5/Runx2 通路有關，其機制可能是EGB761 減少了BMP2 的表達，使BMPR?Ⅰ和BMPR?Ⅱ激活減少，抑制了Smad1/5 復合物磷酸化后由胞漿轉(zhuǎn)位進入細胞核，從而進一步抑制了調(diào)節(jié)各種靶基因的轉(zhuǎn)錄包括Runx2和Msx2的表達。

綜上所述，本研究首次證實，EGB761 可能通過減少BMP2的表達抑制Smad1/5磷酸化，阻止其由胞漿進入細胞核，從而抑制了Runx2和Msx2的表達上調(diào)，抑制了BMP2/Smad1/5/Runx2 信號通路的激活，緩解了瓣膜間質(zhì)細胞鈣化及成骨樣分化。這一研究結(jié)果為將來臨床防治鈣化性主動脈瓣疾病提供了新的分子靶點及方向。