張靜靜，祝超瑜，肖元元，蔣伏松，高清歌，方云云，魏 麗

1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院生物系，上海 201306；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海 200233

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是由遺傳與環(huán)境因素共同作用引起的代謝性疾?。?］，異?；虻倪z傳使后代具有糖尿病易感性。胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）是一種能有效調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)的腸促胰島素激素，可刺激胰島β 細(xì)胞再生、胰島素分泌，減少胰高血糖素釋放，延緩胃排空，減少肝糖原輸出，促進(jìn)脂肪組織脂解等［2-4］，其類似物作為一種新型降糖藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。GLP-1主要通過與其受體GLP-1R（glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R）結(jié)合發(fā)揮生理功能。最近研究發(fā)現(xiàn)GLP-1R基因的遺傳變異會影響其結(jié)構(gòu)組成及生理功能［5］，且GLP-1R基因多態(tài)性與糖尿病易感性相關(guān)［6］。美國健康人群中，GLP-1R單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點rs3765467 GA基因型個體胰島素釋放量遠(yuǎn)大于GG基因型個體［7］。對韓國人群的研究［8］發(fā)現(xiàn)，rs37675467（G/A）突變可降低T2DM 的風(fēng)險。目前，GLP-1R基因多態(tài)性與中國T2DM 相關(guān)研究尚不完善。迄今為止，尚無研究發(fā)現(xiàn)rs3765467 多態(tài)性與中國人群T2DM 發(fā)病相關(guān)。本研究采用多重PCR技術(shù)，結(jié)合高通量重測序檢測GLP-1R外顯子區(qū)域SNPs 位點多態(tài)性在我國人群中的分布，并進(jìn)一步評估多態(tài)性位點與T2DM及臨床代謝指標(biāo)的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究共納入463 例研究對象。其中T2DM 組318例，均為2018—2019 年上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院（臨港院區(qū)）內(nèi)分泌代謝科收治的住院患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合1999 年WHO 的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］：空腹血糖≥7.0 mmol/L，或糖尿病癥狀+隨機血糖≥11.1 mmol/L，或口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）2 h 血糖≥11.1 mmol/L。②相互之間無血緣關(guān)系。③年齡＞18周歲。④漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有惡性腫瘤史、急性感染。②有嚴(yán)重的肝腎功能損傷。③患有腦梗死、心肌梗死、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。④有甲狀腺功能亢進(jìn)癥、甲狀腺功能減退癥等其他內(nèi)分泌相關(guān)疾病。正常對照組145 例，為本院體檢中心健康體檢者，空腹血糖＜6.0 mmol/L，且餐后2 h 血糖＜7.8 mmol/L，糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）＜6.0%；相互之間無血緣關(guān)系，無糖尿病家族史，無糖尿病史。本研究獲上海市第六人民醫(yī)院（臨港院區(qū)）倫理委員會批準(zhǔn)（審批編號：2016-004），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 收集所有入組對象的年齡、性別、體質(zhì)量、身高、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、家族史、病程等資料，并計算體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI），公式為： BMI （kg/m2） = 體質(zhì)量（kg）/身高的平方（m2）。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測 胰島功能及血糖指標(biāo)：葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）及餐后2 h 血糖（2-hour postprandial blood glucose，2 h PG），化學(xué)發(fā)光法測定空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、餐后2 h 胰島素（2 hours insulin，2 h INS），高效液相色譜法檢測HbA1c、糖化白蛋白（glycated albumin，GA）。血脂譜：葡萄糖氧化酶法測定血清總膽固醇（total cholesterol，TC），甘油磷酸氧化酶法測定三酰甘油（triacylglycerol，TAG），日立76002020 型生化自動分析儀（計算法） 測定低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-Ch）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol， HDL-Ch）。 根據(jù)FBG、FINS 檢測結(jié)果，計算胰島素抵抗指數(shù)（homa insulin- resistance，HOMA-IR）=（FBG×FINS）/22.5 和胰島β 細(xì)胞功能指數(shù)（homa islet beta cell function index，HOMA-β）=20×FINS/（FBG-3.5）。

1.2.3 DNA 提取及SNPs 位點檢測 收集所有研究對象肘靜脈血于5 mL EDTA 抗凝管中，-80 ℃冰箱保存；使用血液基因組DNA 提取試劑盒（上海萊楓生物科技有限公司）提取基因組DNA，SpectraMax i3x酶標(biāo)儀（上海達(dá)邁生物科技有限公司）檢測DNA 樣本質(zhì)量，保證其濃度≥50 ng/μL，吸光度A260/A280 值介于1.8～2.0，提取的DNA于-80 ℃冰箱保存。

據(jù)NCBI上人類GLP-1R基因DNA 參考序列，設(shè)計多重PCR 特異性引物；以提取的全基因組DNA 樣本為模板，進(jìn)行PCR擴增，不同的樣本以相應(yīng)的Barcode引物區(qū)分，而后對擴增子進(jìn)行二代高通量重測序［HiSeq X Ten測序儀（Illumina，美國）］。測序結(jié)果使用生物信息學(xué)方法分析，最終獲得每個位點的變異信息。

1.2.4 變異位點檢測 高通量測序過程中會存在一定比例的測序質(zhì)量較低的數(shù)據(jù)，需進(jìn)行質(zhì)控以降低SNPs 假陽性。使用測序數(shù)據(jù)評估軟件FastQC 0.10.8 將序列文件中的低質(zhì)量序列過濾掉，保留的數(shù)據(jù)測序質(zhì)量Q＞30（Q=30指正確率是99.9%），此時測序錯誤率低于0.1%。序列比對之前，用Cutadapt 2.0 軟件除去加在特異性引物兩側(cè)的接頭序列；運用BWA 0.7.17 軟件將二代測序后的短小片段比對定位到參考基因組（GRCh37/hg19）上；隨后使用Genome Analysis Toolkit 3.x 軟件對測序片段中的SNPs 位點進(jìn)行統(tǒng)計和分析；最后以變異處測序深度大于30、變異在所有樣本出現(xiàn)不少于1 次的標(biāo)準(zhǔn)對突變信息進(jìn)行過濾，獲得變異位點。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用Pearsonχ2檢驗進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）分析，以確保研究對象的群體代表性。定量資料以表示，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行分析；偏態(tài)分布的定量資料用M（Q1，Q3）表示，采用非參數(shù)檢驗進(jìn)行分析；定性資料以頻數(shù)（百分率）表示，采用χ2檢驗進(jìn)行分析。分別采用基因型、等位基因、顯性和隱性模型進(jìn)行非條件Logistic 回歸分析，修正年齡、性別、BMI、SBP、TAG、HDL-Ch 等混雜因素，計算比值比（odds ratios，OR）和95%置信區(qū)間（95% confidence interval，95%CI）。為減少非參數(shù)檢驗帶來的損失，對偏態(tài)分布HOMA-IR、HOMA-β 數(shù)據(jù)取自然對數(shù)，使其轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布數(shù)據(jù)，再進(jìn)行參數(shù)檢驗。

應(yīng)用GAS Power Calculator（http：//csg.sph.umich.edu/abecasis/gas_power_calculator/）在線網(wǎng)站計算統(tǒng)計效能，設(shè)置計算條件：顯性模型，OR=1.8，次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）=0.247，人群T2DM 患病率為10%，T2DM 組318 例，正常組145 例。本研究統(tǒng)計效能為0.78。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征比較

本研究共收集318 例T2DM 患者，其中男性158 例，女性160 例；年齡為22～75 歲，平均年齡為（54.53±10.79） 歲。對照組共145 例，其中男性58 例，女性87 例；年齡為31～66 歲，平均年齡為（53.12±6.56）歲。T2DM 組HDL-Ch、HOMA-β 低于對照組，而BMI、SBP、 FBG、 2 h PG、 FINS、 TC、 TAG、 LDL-Ch、HbA1c、GA、HOMA-IR 均高于對照組（均P＜0.05），2組在性別、年齡、DBP、2 h INS水平上差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 研究人群的臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of the study population

2.2 SNPs分型及關(guān)聯(lián)分析

GLP-1R基因外顯子多態(tài)性檢測分析發(fā)現(xiàn)23 個SNPs位點。對位點的基因型和等位基因頻率進(jìn)行病例-對照關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示rs3765467 位點基因型和等位基因頻率在2 組間的分布差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.180，P=0.010；χ2=8.056，P=0.005），說明rs3765467 與T2DM 發(fā)病顯著相關(guān)；其余位點基因型及等位基因頻率在2組間的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

HWE 檢驗表明rs3765467 等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（對照組P=0.893），可代表整體，可進(jìn)行遺傳學(xué)分析。

2.3 GLP-1R rs3765467位點多態(tài)性與T2DM易感性的關(guān)系

通過多種模型分析rs3765467 多態(tài)性與T2DM 易感性的關(guān)系，結(jié)果（表2）顯示：rs3765467 G＞A 突變顯著降低T2DM 患病風(fēng)險（修正后OR=0.587，95%CI0.395～0.872，P=0.008）；與攜帶野生GG基因型個體相比，攜帶GA 基因型（修正后OR=0.507，95%CI0.298～0.864，P=0.012）個體患病風(fēng)險降低；顯性模型中，攜帶rs3765467 GA/AA基因型與攜帶GG基因型的個體相比，T2DM患病風(fēng)險較低（修正后OR=0.502，95%CI0.305～0.829，P=0.007），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。隱性模型中，2 組間rs3765467等位基因及基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 GLP-1R rs3765467位點多態(tài)性與T2DM易感性的關(guān)聯(lián)Tab 2 Association between GLP-1R rs3765467 polymorphism and T2DM susceptibility

據(jù)性別將受試者分為2 個亞組，分別比較亞組內(nèi)rs3765467 在T2DM 組和對照組中的基因型及等位基因頻率（表3）。男性人群中，A等位基因攜帶者患病風(fēng)險顯著低于G 等位基因攜帶者（修正后OR=0.460，95%CI0.249～0.852，P=0.013）；與攜帶野生GG 基因型個體相比，攜帶GA 基因型（修正后OR=0.439，95%CI0.195～0.990，P=0.047）個體患病風(fēng)險降低；顯性模型中，與GG基因型攜帶者相比，GA+AA 基因型者患病風(fēng)險較低（修正后OR=0.403，95%CI0.186～0.871，P=0.021），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；隱性模型中，rs3765467 等位基因及基因型在2組間的分布無顯著性差異。而女性人群中，各種模型下不同基因型攜帶者患病風(fēng)險差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 性別亞組中GLP-1R rs3765467位點多態(tài)性與T2DM易感性的關(guān)聯(lián)Tab 3 Association between GLP-1R rs3765467 polymorphism and T2DM susceptibility in male and female

2.4 基因分型后臨床特征比較

在所有受試者中對GG 和GA+AA 基因型攜帶者的臨床特征進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)GA+AA 基因型攜帶者GA 水平顯著低于GG 基因型攜帶者（P=0.048），而其他指標(biāo)在2 組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表4）。

表4 整體人群不同基因型臨床特征比較Tab 4 Comparison of clinical features of different genotypes

在男性人群中，與GG 基因型攜帶者相比GA+AA 基因型攜帶者FBG水平顯著降低（P=0.016），HbA1c水平顯著降低（P=0.037）（表5）。女性人群中，不同基因型攜帶者的臨床特征無明顯差異。

表5 男性人群不同基因型臨床特征比較Tab 5 Comparison of clinical features of different genotypes in the males

3 討論

GLP-1R基因定位于6號染色體（6p21.2），包含13個外顯子，全長為42 500 堿基對。GLP-1R 屬于G 蛋白偶聯(lián)受體，具有典型的7次跨膜α-螺旋核心結(jié)構(gòu)域和1個胞外結(jié)構(gòu)域，在激素信號接收及受體激活方面發(fā)揮重要作用［10］，是T2DM 的重要治療靶點。近年來，新型降糖藥物GLP-1 受體激動劑以其體重調(diào)控和血糖依賴性降糖等優(yōu)勢廣受歡迎。多項研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1R基因的多態(tài)性與GLP-1受體激動劑敏感性、FBG［11］、胰島細(xì)胞功能［12-13］、T2DM 發(fā)病機制［14］、肥胖［15］、冠狀動脈疾?。╟oronary artery disease，CAD）［16］相關(guān)。研究者將糖尿病患者分為CAD 組和非CAD 組，檢測GLP-1R基因的11 個SNPs 位點，發(fā)現(xiàn)rs4714210 位點GG 基因型患者比其他基因型患者的CAD 風(fēng)險低（OR=0.442，95%CI=0.258～0.757，P=0.002）［16］。房彬彬等［17］發(fā)現(xiàn)中國人群中GLP-1Rrs1042044 位點AC/CC 基因型和T2DM 發(fā)病相關(guān)，其攜帶者患病風(fēng)險增加0.634 倍（P=0.045）。本研究通過多重PCR靶向重測序，共檢測到GLP-1R基因外顯子區(qū)域的23個SNPs位點，通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)rs3765467位點與T2DM發(fā)病相關(guān)。已有研究［18］發(fā)現(xiàn)rs3765467 G 等位基因可顯著降低β 細(xì)胞的胰島素分泌和環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）濃度，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。一項針對日本T2DM 人群的研究［13］發(fā)現(xiàn)，男性中與rs3765467 GA+AA 基因型攜帶者相比，攜帶GG 基因型者胰島素分泌量更低。這些研究提示GLP-1R基因突變在糖尿病發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM 組rs3765467 位點GA+AA 基因型頻率顯著低于對照組；與G 等位基因攜帶者相比，rs3765467位點A等位基因攜帶者患T2DM風(fēng)險顯著降低；提示rs3765467（G/A）變異與T2DM 的發(fā)病相關(guān)，A 等位基因可能是T2DM 的保護(hù)因素。韓國人群GLP-1R變異與T2DM 相關(guān)性研究［8］發(fā)現(xiàn)rs3765467（G/A）突變可降低T2DM 風(fēng)險（OR=0.84，P=3.55×10-8），這與我們的研究結(jié)果相似。但也有研究與我們的結(jié)果不同。李蕊等［19］分析中國山東137例T2DM患者及100例健康人rs3765467位點多態(tài)性的分布特征，發(fā)現(xiàn)T2DM 人群GG 基因型攜帶者TAG 水平高于GG+GA 基因型攜帶者（P=0.03），但并未發(fā)現(xiàn)rs3765467 與T2DM 相關(guān)。這可能是由于2 項研究之間存在樣本量的差異，也可能是因生活環(huán)境、遺傳背景的差異，導(dǎo)致rs3765467 位點對2 型糖尿病的影響存在地區(qū)異質(zhì)性。

為闡明rs3765467 位點多態(tài)性對T2DM 的影響，本研究對不同基因型下臨床特征進(jìn)行比較。整體人群中，與GG 基因型攜帶者相比，GA+AA 基因型攜帶者GA 水平顯著降低，HbA1c 水平有下降趨勢，這提示GLP-1Rrs3765467 多態(tài)性參與血糖水平的調(diào)控。二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制劑是一種常用降糖藥，可有效防止GLP-1 的降解。一項關(guān)于韓國T2DM 患者對DPP-4 抑制劑的響應(yīng)的研究［20］發(fā)現(xiàn)，與GG 基因型攜帶者相比，攜帶GA+AA 基因型的T2DM 患者對DPP-4 抑制劑的應(yīng)答反應(yīng)更高，HbA1c 降低幅度更大。這與我們的研究結(jié)果相似，表明rs3765467 位點多態(tài)性與血糖水平相關(guān)，GA+AA 基因型更利于保持血糖穩(wěn)態(tài)。

按性別分組，男性人群中T2DM 組rs3765467 A 等位基因頻率顯著低于對照組，A等位基因攜帶者患病風(fēng)險顯著降低。臨床特征分析顯示，與GG 基因型攜帶者相比，GA+AA 基因型攜帶者HbA1c、FBG 水平顯著降低，這與整體人群的情況一致。而女性人群中，T2DM組與對照組間的等位基因、基因型頻率分布均不存在差異，不同基因型間臨床生化指標(biāo)也不具有顯著性差異。我們推測，rs3765467 A 等位基因可能是防止男性T2DM 發(fā)生的特異性保護(hù)因素，A等位基因有助于維持血糖穩(wěn)態(tài)，但未來仍需要更大的樣本量來驗證不同性別人群中rs3765467 多態(tài)性與血糖的相關(guān)性。

GLP-1R基因rs3765467 變異與T2DM 相關(guān)的機制尚未闡明。已知GLP-1R 在與其配體互作過程中，其胞外域先與配體C 端結(jié)合，從而確保配體的N 端能夠結(jié)合到受體核心區(qū)域，進(jìn)而激活受體；GLP-1R 胞外域中的氨基酸殘基在其自身折疊及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中發(fā)揮關(guān)鍵作用［21］。蛋白序列分析顯示，rs3765467 位點G/A 突變導(dǎo)致GLP-1R 胞外結(jié)構(gòu)域的131 位精氨酸（CGG）被谷氨酰胺（CAG）替代。我們推測，rs3765467 位點G/A 突變導(dǎo)致氨基酸殘基替換可能會影響GLP-1R 與其配體的結(jié)合效率，影響后期細(xì)胞信號傳導(dǎo)。

綜上，本研究通過病例-對照研究，首次發(fā)現(xiàn)GLP-1Rrs3765467與上海漢族人群T2DM 發(fā)病風(fēng)險相關(guān)；次要等位基因A 可能有助于維持血糖穩(wěn)態(tài)，是T2DM 的保護(hù)因素，這種保護(hù)性尤其在男性中顯著。未來有待采用分子生物學(xué)的方法驗證位點的功能，從而為探討T2DM 發(fā)病機制及基因靶向治療提供一定的理論依據(jù)。