李莉莎，李建輝，何 斌，吳楠楠，朱同玉，郭曉奎，3，陳崢宏

1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550025；2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海噬菌體研究所，上海 201508；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院，上海 200025

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是重要的醫(yī)院和社區(qū)獲得性機(jī)會(huì)致病菌，臨床上可引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)等多部位感染。近年來(lái)，過(guò)量使用和濫用抗生素導(dǎo)致多重耐藥（multidrug resistant，MDR）Kp感染的比例逐年升高，特別是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBL）和碳青霉烯酶［包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiellapneumoniaecarbapenemases，KPC）、金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo β-lactamases，MBL）、OXA-48 樣碳青霉烯酶（OXA-48-like carbapenemases，OXA-48）］菌株已成為院內(nèi)感染的主要病原體［1］。

噬菌體在1915 年被發(fā)現(xiàn)之初就被用于治療細(xì)菌感染性疾病，但隨著廣譜抗生素的發(fā)現(xiàn)及臨床應(yīng)用，人們對(duì)噬菌體的臨床研究一度失去了興趣［2］。近年來(lái)，泛耐藥菌感染率不斷上升，而新型抗生素的研發(fā)速度越來(lái)越落后于耐藥菌產(chǎn)生的速度。由于細(xì)菌的抗生素耐藥性并不影響噬菌體的殺菌能力，因此噬菌體作為一種潛在的替代療法重新受到了重視。雖然噬菌體療法對(duì)控制多重耐藥菌感染具有巨大潛力［3］，但臨床推廣還面臨諸多瓶頸。目前，噬菌體療法在國(guó)內(nèi)外均為小規(guī)模的臨床試驗(yàn)，給藥方法、給藥劑量及療效評(píng)估的研究報(bào)道較少。本研究針對(duì)1 例噬菌體治療泛耐藥Kp 肺部感染的病例，分析了噬菌體在治療過(guò)程中的殺菌能力及在體內(nèi)的代謝特征，旨在為噬菌體療法的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，指導(dǎo)臨床治療方案的制訂。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

患者，男性，54 歲，因頭部外傷昏迷入院。入院后診斷為特重型顱腦損傷并伴有泛耐藥Kp 肺部感染，臨床給予呼吸機(jī)輔助呼吸及抗感染等處理。使用抗生素治療過(guò)程如圖1所示。治療后肺部感染病灶仍存在，臨床癥狀未緩解，請(qǐng)求使用噬菌體治療。依照上海市公共衛(wèi)生臨床中心噬菌體治療超級(jí)細(xì)菌感染的安全性和有效性倫理批件（批號(hào)：2020-S157-01），患者入組和排除標(biāo)準(zhǔn)如下。入組標(biāo)準(zhǔn)：①1～90 周歲多重耐藥細(xì)菌感染患者（以上海市公共衛(wèi)生臨床中心或其他三級(jí)甲等及以上醫(yī)院藥敏檢測(cè)結(jié)果為據(jù)）。②患者感染的病原菌應(yīng)滿足如下條件之一：病原菌對(duì)抗生素全耐藥；病原菌對(duì)關(guān)鍵抗生素耐藥；病原菌體外對(duì)關(guān)鍵抗生素敏感但使用此抗生素治療無(wú)效或效果不明顯（效果不明顯定義為同種耐藥病原菌反復(fù)感染或患者產(chǎn)生抗生素依賴性無(wú)法停藥達(dá)2 個(gè)月以上）；病原菌對(duì)關(guān)鍵敏感抗生素使用受限（指患者器官功能損傷或?qū)Υ丝股剡^(guò)敏）。③能夠通過(guò)外敷、感染灶噴灑、霧化吸入、灌注、局部注射或引流管給藥者。④受試者及家屬（或監(jiān)護(hù)人）充分閱讀、理解并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)菌感染能被抗生素治療有效控制者。②除靜脈注射給藥外無(wú)其他給藥途徑者。③超過(guò)本單位醫(yī)療服務(wù)負(fù)荷。④經(jīng)研究者判定不適合參與本研究的患者。

圖1 患者使用抗生素和噬菌體的治療經(jīng)過(guò)Fig 1 Course of antibiotics and phage treatment for the patient

1.2 噬菌體的篩選

Kp 分離自患者的痰液標(biāo)本，經(jīng)血平板分離培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。使用稀釋法對(duì)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取單克隆菌經(jīng)37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，使用雙層瓊脂平板從噬菌體庫(kù)（共267 株）中篩選噬菌體，每株噬菌體取2 μL 點(diǎn)板。點(diǎn)板后37 ℃培養(yǎng)6 h，統(tǒng)計(jì)細(xì)菌的裂解譜，選取清晰且透亮噬斑對(duì)應(yīng)的噬菌體用于治療。

1.3 噬菌體的制備

使用原始宿主菌利用液體培養(yǎng)法擴(kuò)增噬菌體，并測(cè)定噬菌體的滴度。選取每毫升滴度大于109個(gè)噬斑形成單位（plaque forming unit，PFU）的噬菌體擴(kuò)增液，使用生理鹽水透析3 次，經(jīng)0.22 μm 濾器過(guò)濾后進(jìn)行藥品生產(chǎn)管理規(guī)范（good manufacturing practice，GMP）包裝。GMP產(chǎn)品經(jīng)無(wú)菌檢測(cè)，用噬菌體對(duì)應(yīng)的宿主菌進(jìn)行滴度測(cè)定后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 噬菌體治療方案

根據(jù)噬菌體篩選結(jié)果，選用噬菌體Φ59 經(jīng)霧化吸入治療，每次使用109PFU/mL 的噬菌體液5 mL，每隔4 h治療1 次，共治療4 次。取每次治療前后的痰液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及噬菌體滴度測(cè)定。治療1 d 后，每日取患者痰液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3 d。治療期間停止使用抗生素。

1.5 噬菌體治療過(guò)程中患者樣本采集及檢測(cè)

在噬菌體治療過(guò)程中，每小時(shí)取患者痰液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，并且鋪板計(jì)數(shù)痰液中的噬菌體量。同時(shí)，為了檢測(cè)霧化吸入時(shí)噬菌體是否入血，我們?cè)诓煌臅r(shí)間點(diǎn)采集患者的血液樣本進(jìn)行鋪板計(jì)數(shù)噬菌體量。具體采樣時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 痰液與血液樣本采集方案Tab 1 Scheme for collection of sputum and blood samples

使用檢驗(yàn)科常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)程序培養(yǎng)細(xì)菌，依據(jù)菌落形態(tài)并進(jìn)行有無(wú)革蘭陰性菌生長(zhǎng)判定。其中，對(duì)治療前及治療完成后取樣的樣本進(jìn)行分離純化及質(zhì)譜鑒定。痰液中噬菌體的定量：采用以SM緩沖液（200 mmol/L氯化鈉、16 mmol/L 硫酸鎂、0.1 mol/L 三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、0.02%明膠；pH 值7.4～7.6）對(duì)痰液進(jìn)行稀釋后離心取上清，血樣經(jīng)離心后取上清，倍比稀釋成不同濃度梯度后各取10 μL 與400 μL 對(duì)數(shù)期宿主菌，混合后平板培養(yǎng)，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。翌日，根據(jù)計(jì)數(shù)平板上噬菌體斑的個(gè)數(shù)，計(jì)算噬菌體效價(jià)（PFU/mL=平板上噬斑的平均個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)）。結(jié)果采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行繪圖。

1.6 菌株種屬鑒定

從-80 ℃冰箱選取菌株，按三區(qū)劃線法接種至哥倫比亞血瓊脂平板上，放入37 ℃恒溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)后再次純化、培養(yǎng)。挑取單一菌落，應(yīng)用甲酸提取法萃取出菌株蛋白，取1 μL 上清液滴至48 孔靶板上，加1 μL 基質(zhì)液，干燥后采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)進(jìn)行鑒定。以上所有操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 臨床治療用噬菌體配對(duì)篩選

取患者噬菌體治療前的痰液進(jìn)行分離得到菌株，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為Kp，自行命名為KpLJW-1。使用上海市公共衛(wèi)生臨床中心的Kp 噬菌體庫(kù)進(jìn)行噬菌體篩選。結(jié)果如圖2，在含有267 株噬菌體的庫(kù)中，編號(hào)為Φ59 的噬菌體能裂解KpLJW-1。經(jīng)GMP 包裝后，將KpLJW-1測(cè)定滴度為109PFU/mL的Φ59噬菌體用于進(jìn)一步治療。

圖2 臨床分離株KpLJW-1的噬菌體裂解譜Fig 2 Phage lysis spectrum of clinical isolate KpLJW-1

2.2 噬菌體治療過(guò)程中患者痰液中的噬菌體及細(xì)菌變化

為了研究噬菌體使用頻率及給藥時(shí)間，我們?cè)谥委熯^(guò)程中每小時(shí)取患者痰液樣本，測(cè)定痰液中的噬菌體量及細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。結(jié)果（圖3）顯示，第一次霧化吸入后2 h 內(nèi)，噬菌體量增加，說(shuō)明噬菌體在體內(nèi)感染宿主菌并進(jìn)行了增殖。在3 h 時(shí)噬菌體量維持不變，而4 h 時(shí)噬菌體量開(kāi)始下降。第二次霧化吸入噬菌體后，噬菌體在體內(nèi)的增殖規(guī)律與第一次霧化后相同。但第三次治療后噬菌體量?jī)H有少量增加，說(shuō)明經(jīng)過(guò)前2次治療，噬菌體殺滅了大部分靶細(xì)菌從而噬菌體不再增殖。這一結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于肺部霧化吸入噬菌體治療，連續(xù)治療2次即可以達(dá)到裂解靶向菌的效果。

圖3 痰液中噬菌體定量及細(xì)菌生長(zhǎng)情況Fig 3 Titer of phages and the survival of bacteria in sputum

2.3 霧化吸入治療時(shí)噬菌體入血量的檢測(cè)

在治療前，第一次治療開(kāi)始后2 h、4 h以及整個(gè)治療療程結(jié)束后4 h，對(duì)血液中的噬菌體進(jìn)行鋪板計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示均未在血液中檢測(cè)到噬菌體，說(shuō)明經(jīng)霧化吸入進(jìn)行噬菌體治療過(guò)程中，噬菌體未入血。

2.4 噬菌體治療后痰液中細(xì)菌的變化

從治療過(guò)程中的細(xì)菌培養(yǎng)情況看，在治療第4、5 h未檢出Kp，但第6 h 及以后的痰液標(biāo)本中均培養(yǎng)出Kp（圖3）。從菌落形態(tài)上看，有2株不同的Kp，分別命名為KpLJW-2 和KpLJW-3。對(duì)比這2 株菌的裂解譜分析發(fā)現(xiàn)，KpLJW-2 仍對(duì)治療用噬菌體敏感，而KpLJW-3 對(duì)治療用噬菌體耐受；說(shuō)明經(jīng)過(guò)噬菌體治療，菌株發(fā)生了變化（圖4）。

2.5 臨床結(jié)局

患者經(jīng)噬菌體治療后，咳嗽咳痰癥狀好轉(zhuǎn)。肺部計(jì)算機(jī)斷層掃描（computer tomography，CT）顯示，治療前患者兩側(cè)胸腔積液伴兩下肺部分膨脹不全及反應(yīng)性炎癥（圖5A）；治療后兩側(cè)胸腔積液明顯減少，炎癥反應(yīng)減輕（圖5B）。

3 討論

3.1 治療肺部感染時(shí)噬菌體在體內(nèi)的變化

全球范圍內(nèi)，隨著對(duì)抗生素耐藥和人體微生物群重要性認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們對(duì)噬菌體用于治療耐藥菌感染的潛力產(chǎn)生了濃厚的興趣。噬菌體作為一種活的生物制劑，環(huán)境因素不影響其感染能力是保證其有效殺菌的主要因素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［4］表明，噬菌體療法的效果取決于噬菌體在感染部位的濃度，以及靶向和殺滅細(xì)菌、阻止細(xì)菌生長(zhǎng)、清除感染的能力。研究［5］顯示，噬菌體在不同溶液中的穩(wěn)定性存在明顯差異，在加工和儲(chǔ)存過(guò)程中亦會(huì)造成噬菌體滴度的下降。與傳統(tǒng)的化學(xué)抗菌劑相比，噬菌體作為活的生物制劑，在體內(nèi)存在復(fù)雜的代謝動(dòng)力學(xué)特性［6］。此特性主要受噬菌體增殖特性和人體對(duì)噬菌體免疫清除作用的影響［7-8］。目前，關(guān)于噬菌體制劑在噬菌體治療時(shí)的動(dòng)力學(xué)特性以及其影響因素的研究報(bào)道較少。從本研究結(jié)果看，使用噬菌體進(jìn)行霧化吸入治療后，噬菌體并未入血。在肺部感染病原菌的情況下，噬菌體在體內(nèi)先增殖裂解細(xì)菌，然后其自身濃度開(kāi)始下降，說(shuō)明噬菌體在體內(nèi)殺滅了大量靶細(xì)菌后被代謝清除或稀釋。

3.2 細(xì)菌耐受噬菌體的產(chǎn)生及其治療方案的制定

目前已有多篇報(bào)道［9-10］表明，噬菌體與細(xì)菌相互作用后，細(xì)菌可以快速產(chǎn)生噬菌體耐受；噬菌體耐受菌的產(chǎn)生是制約臨床治療效果的重要因素［11］。從本研究結(jié)果來(lái)看，在治療1 d 結(jié)束后仍有細(xì)菌培養(yǎng)出來(lái)，且細(xì)菌的裂解譜有所不同，說(shuō)明細(xì)菌已經(jīng)發(fā)生了變化，進(jìn)化后的細(xì)菌不能被噬菌體殺滅，這也是導(dǎo)致噬菌體治療不能徹底清除病原菌的主要原因之一。對(duì)于肺部感染，經(jīng)2次霧化吸入治療即可達(dá)到噬菌體使用的最佳效果，延長(zhǎng)治療次數(shù)并不能為患者帶來(lái)更多的臨床收益。因此，治療過(guò)程中需及時(shí)評(píng)估細(xì)菌變化趨勢(shì)，這將有利于優(yōu)化噬菌體治療方案［12］。

綜上所述，噬菌體作為一種具有廣闊應(yīng)用前景的生物殺菌制劑，分析其治療過(guò)程中在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化將有助于完善噬菌體治療的標(biāo)準(zhǔn)程序，并有助于預(yù)測(cè)噬菌體療法的預(yù)后。進(jìn)一步研究噬菌體療法在體內(nèi)發(fā)揮作用的機(jī)制并評(píng)估其在噬菌體治療中的作用，將有助于噬菌體臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)化。