陳江龍，陳 砼，呂志寶，王雪莉，盛慶豐

1.上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院普外科，上海 200062；2.上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院病理科，上海 200062

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是發(fā)生在新生兒特別是早產(chǎn)兒中的一種較為常見的死亡率較高的胃腸道急癥。研究［1-3］顯示，NEC 在全世界活產(chǎn)兒中的總發(fā)病率為0.03%～0.24%，在胎齡22～28 周早產(chǎn)兒的發(fā)病率為7%～13%，在出生體質(zhì)量低于1 500 g 的早產(chǎn)兒中的發(fā)病率約為6.9%。且另有研究［4］發(fā)現(xiàn)NEC患兒的死亡率極高，即平均約為40%；盡管針對新生兒的營養(yǎng)和支持技術(shù)不斷提升，但該類患兒的死亡率仍超過30%。目前，有關(guān)NEC 的發(fā)病機(jī)制尚未被明確，臨床治療手段有限，一般以禁食、胃腸減壓、抗感染、營養(yǎng)支持等保守治療為主；一旦發(fā)生胃腸道穿孔壞死，只能采取手術(shù)治療，且效果并不理想。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由19～25 個核苷酸組成的非編碼RNA。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在NEC 的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，如miRNA 可參與調(diào)控NEC 發(fā)病過程中的炎癥通路、與NEC 的預(yù)后相關(guān)、可作為NEC 的早期診斷指標(biāo)等［5-7］。近年來的研究［8-11］發(fā)現(xiàn)，miR-146a是一種抗炎性miRNA（包括miR-146a-5p、miR-146a-3p），可參與調(diào)控新生動物腸道固有免疫與腸道炎癥。本研究通過檢測NEC 患兒腸道中miR-146a-5p 的表達(dá)水平，分析其與腸道組織病理評級之間相關(guān)性，并比較miR-146a-5p 高表達(dá)與低表達(dá)患兒在不同臨床資料中的分布，為NEC 腸道損傷程度提供判定指標(biāo)，并為闡明NEC腸道損傷的機(jī)制提供新的研究思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象及其資料、標(biāo)本收集

選擇2014 年1 月—2018 年12 月于上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院救治的NEC 患兒和腸閉鎖（intestinal atresia，IA）患兒為研究對象。收集NEC 患兒的外科手術(shù)腸道組織標(biāo)本17 例，分別于標(biāo)本的炎癥缺血壞死邊緣處、手術(shù)腸道切口邊緣處取一小塊組織，記為NEC 炎癥組（NECinflamed 組）和NEC 未受影響組（NEC-unaffected 組），所有標(biāo)本的取材均需避免完全壞死處的組織。收集IA 患兒的外科手術(shù)腸道組織標(biāo)本22 例，設(shè)為對照組（即為IA組）。

同時，收集上述患兒的臨床資料，包括性別、孕周、出生體質(zhì)量、喂養(yǎng)方式、C 反應(yīng)蛋白濃度（C-reaction protein，CRP）、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比率（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、腸道切除長度、住院天數(shù)和預(yù)后情況等。

本研究經(jīng)上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：2018RY027-E01），所有標(biāo)本的獲取均已取得患兒監(jiān)護(hù)人的同意并簽署了知情同意書。

1.2 NEC動物模型建立及組織標(biāo)本獲取

選取5～7 日齡SPF 級C57BL/6J 新生小鼠24 只及母鼠6 只（購自上海杰思捷實驗動物有限公司），動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0004。采用隨機(jī)數(shù)字表將新生小鼠分為NEC 造模組和對照組，每組12 只。新生小鼠及母鼠均飼養(yǎng)于SPF 級動物房中，使用許可證號：SCXK（滬）2018-0004。母鼠飼以顆粒飼料，自由食水，12 h照明/12 h 黑暗，晝夜循環(huán)。采用人工配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激的方法飼養(yǎng)NEC 造模組新生小鼠［12-15］，具體操作如下：每4 h 喂養(yǎng)1 次人工配方奶（30%雅培動物配方奶），喂養(yǎng)后1 h 將新生小鼠置于氮氣罐中90 s 行缺氧處理，而后于4 ℃冰箱內(nèi)10 min行冷處理；每日需操作2次，連續(xù)處理4 d。嚴(yán)密觀察小鼠的生存狀況并記錄其每日的體質(zhì)量，如出現(xiàn)NEC 典型癥狀（嚴(yán)重腹脹、血便、發(fā)紺等），則斷頸處死小鼠；如無上述癥狀，則于96 h 后處死小鼠。對照組新生小鼠由母鼠喂養(yǎng)96 h后，斷頸處死。收集2組小鼠的末端回腸組織標(biāo)本。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院實驗動物管理及倫理委員會審批（審批號：2018040）。

1.3 組織標(biāo)本的蘇木精-伊紅染色及病理評級

將各組新生小鼠的末端回腸組織標(biāo)本及各組患兒腸道組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定，而后行乙醇梯度脫水、石蠟包埋。切片厚度為4 μm。分別經(jīng)蘇木精、伊紅染色（武漢塞維爾生物科技有限公司），中性樹膠封片。于顯微鏡下鏡檢，并拍攝圖片進(jìn)行分析。

采用雙盲法，參考Caplan 等［12］與Pisano 等［16］的評級方法，由2 位病理科醫(yī)師依據(jù)小鼠組織標(biāo)本的蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H-E staining，H-E 染色）結(jié)果，獨立對腸道組織破壞程度進(jìn)行病理評估。具體評級如下：0 級為腸道無損傷，腸組織黏膜絨毛、固有層等結(jié)構(gòu)清晰正常；1 級為腸道輕度損傷，絨毛尖部輕微損傷或輕微黏膜下層或固有層分離，炎性細(xì)胞浸潤；2 級為腸道中度損傷，部分絨毛丟失或中度黏膜下層或固有層分離，或黏膜下層和肌層水腫，較多炎性細(xì)胞浸潤；3 級為腸道中度損傷，重度黏膜下層或固有層分離，或嚴(yán)重黏膜下層和肌層水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤；4 級為絨毛消失，腸壁全層壞死。當(dāng)組織病理評級=1 級，認(rèn)為可疑NEC 發(fā)生；≥2 級，認(rèn)為新生小鼠NEC 造模成功。

1.4 組織標(biāo)本中miR-146a-5p的定位及表達(dá)

采用原位雜交的方法檢測各組新生小鼠的末端回腸組織標(biāo)本及各組患兒腸道組織標(biāo)本中miR-146a-5p 的定位及表達(dá)，具體步驟參照RNA 熒光原位雜交試劑盒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）的說明書。實驗中所用探針序列為5′-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3′-FAM，濃度為1 μmol/L，孵育溫度為37 ℃，時間為16 h，可較好地避免脫靶效應(yīng)。隨后，于顯微鏡下觀察，將與DAPI 共表達(dá)的帶有綠色熒光信號的細(xì)胞記為陽性細(xì)胞；隨機(jī)選擇3 個視野，將陽性細(xì)胞數(shù)量的平均值作為該標(biāo)本的陽性細(xì)胞統(tǒng)計數(shù)，其統(tǒng)計數(shù)即為miR-146a-5p 表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。定量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。定性資料以頻數(shù)表示，采用χ2檢驗或Fisher’s 精確概率法進(jìn)行分析。采用Pearson相關(guān)系數(shù)對NEC 患兒腸道中miR-146a-5p 表達(dá)水平與腸道組織病理評級進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠組織標(biāo)本的H-E染色與病理評級

對2 組新生小鼠的末端回腸組織標(biāo)本進(jìn)行H-E 染色，并由病理科醫(yī)師針對染色結(jié)果進(jìn)行組織病理評級。結(jié)果（圖1）顯示，對照組小鼠的組織病理評級均為0 級，而NEC 造模組小鼠為1～4級不等（其中，1級雖為可疑NEC發(fā)生，但因該級小鼠也存在腸道損傷，因此將其歸為NEC造模組）。

圖1 2組小鼠末端回腸組織標(biāo)本的H-E染色（×100）及組織病理評級Fig 1 H-E staining(×100)and histopathological grade of terminal ileum tissue samples of mice in the two groups

2.2 小鼠組織標(biāo)本中miR-146a-5p的表達(dá)

采用原位雜交檢測2 組小鼠末端回腸組織標(biāo)本中miR-146a-5p 的定位與表達(dá)，結(jié)果（圖2）顯示NEC 造模組小鼠的miR-146a-5p 主要表達(dá)于腸道固有層，且其在該組小鼠的表達(dá)水平高于對照組（P=0.000）。

圖2 原位雜交檢測2組小鼠末端回腸組織標(biāo)本中miR-146a-5p的表達(dá)Fig 2 Expression of miR-146a-5p in terminal ileum tissue samples of mice in the two groups by in situ hybridization

2.3 患兒組織標(biāo)本的H-E染色

對NEC 患兒和IA 患兒的腸道組織標(biāo)本行H-E 染色，結(jié)果（圖3）顯示NEC炎癥組患兒的腸道組織絨毛斷裂或溶解、黏膜下層和肌層水腫、炎癥細(xì)胞浸潤及腸道全層溶解壞死等情況較NEC未受影響組和IA組更為嚴(yán)重。

圖3 3組患兒腸道組織標(biāo)本的H-E染色（×100）Fig 3 H-E staining of intestinal tissue samples in the three groups(×100)

2.4 患兒組織標(biāo)本中miR-146a-5p的表達(dá)

采用原位雜交檢測NEC 患兒和IA 患兒的腸道組織標(biāo)本中miR-146a-5p 的定位與表達(dá)，結(jié)果（圖4）顯示所有患兒的miR-146a-5p均主要表達(dá)于固有層中，且其在NEC炎癥組的表達(dá)水平高于NEC 未受影響組和IA 組（均P=0.000）。

圖4 原位雜交檢測3組患兒腸道組織標(biāo)本中miR-146a-5p的表達(dá)Fig 4 Expression of miR-146a-5p in intestinal tissue samples of children in the three groups by in situ hybridization

2.5 NEC 患兒miR-146a-5p 表達(dá)與腸道組織病理評級及臨床資料之間相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)系數(shù)對NEC患兒標(biāo)本中miR-146a-5p表達(dá)水平與組織病理評級進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖5）顯示二者呈正相關(guān)（P=0.015，r=0.578）。根據(jù)NEC 患兒腸道組織標(biāo)本中miR-146a-5p 的表達(dá)水平，將其分為高表達(dá)（陽性細(xì)胞數(shù)≥100 個）與低表達(dá)（陽性細(xì)胞數(shù)＜100個），并就其二者在不同臨床資料中分布進(jìn)行比較，結(jié)果（表1）顯示miR-146a-5p高表達(dá)患兒中腸道切除長度≥5 cm的人數(shù)較miR-146a-5p低表達(dá)患兒更多（P=0.005）。

表1 NEC 患兒腸道組織標(biāo)本中miR-146a-5p 高表達(dá)與低表達(dá)在不同臨床資料中的分布比較Tab 1 Comparison of high and low expression of miR-146a-5p in intestinal tissues samples of NEC children in different clinical data

圖5 NEC患兒腸道組織標(biāo)本中miR-146a-5p表達(dá)水平與組織病理評級的相關(guān)性分析Fig 5 Correlation analysis between expression of miR-146a-5p and histopathological grade in intestinal tissues samples of children with NEC

3 討論

研究［17-20］顯示，早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量、配方奶喂養(yǎng)、感染與紅細(xì)胞輸注等是NEC 發(fā)生的主要危險因素。Bazacliu 等［21］發(fā)現(xiàn)，NEC 患兒存在著較多的短期及長期并發(fā)癥，如顱內(nèi)出血、短腸綜合征、神經(jīng)發(fā)育損害、全身發(fā)育不良或遲緩等。臨床上，NEC 以全身性系統(tǒng)性的瀑布炎性反應(yīng)和廣泛的腸道壞死穿孔為特征，可累及腸道出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤，黏膜下水腫出血，絨毛結(jié)構(gòu)破壞，嚴(yán)重者將出現(xiàn)腸道全層壞死穿孔［22］。NEC 腸道損傷包括2個方面：一是腸道組織結(jié)構(gòu)的完整性，即腸道破壞程度，反映了炎癥對腸道絨毛等屏障的破壞情況；本研究中我們采用基于H-E 染色的組織病理評級進(jìn)行評估。二是腸道損傷范圍，即腸道穿孔壞死的長度；本研究中我們采用腸道切除長度加以分析。

既往研究［23］發(fā)現(xiàn)，miR-146a 在葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的炎癥性腸病中參與腸道免疫與腸道屏障功能的調(diào)節(jié)；該方法誘導(dǎo)動物模型的原理及腸道的病理狀態(tài)與本研究NEC 造模極為相似。Chassin等［8］發(fā)現(xiàn)，在新生小鼠腸道中miR-146a可介導(dǎo)保護(hù)性的內(nèi)源性免疫耐受反應(yīng)。本課題組的前期研究［24］發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p 可通過抑制巨噬細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3［nucleotide-binding oligomerization domain（NOD） -like receptors family， pyrin domain containing 3，NLRP3］炎癥小體的激活來抑制NEC 腸道炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮NEC腸道的保護(hù)作用。He等［25］亦發(fā)現(xiàn)，miR-146a可以保護(hù)腸道以避免發(fā)生缺血再灌注損傷。因此，上述研究均提示miR-146a具有腸道保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，作為抗炎性miRNA，miR-146a-5p在腸道中的表達(dá)水平與腸道組織結(jié)構(gòu)完整性（組織病理評級）和損傷范圍（腸道切除長度）相關(guān)?？寡仔砸蛩嘏c損傷程度一同升高表明，可能是機(jī)體試圖通過上調(diào)miR-146a-5p的表達(dá)來抑制腸道炎癥，但炎癥已超出miR-146a-5p的調(diào)控范圍；亦或是miR-146a-5p 主要表達(dá)于M1 型巨噬細(xì)胞，參與炎癥瀑布反應(yīng)，因此炎癥反應(yīng)越重則miR-146a-5p 的表達(dá)越高。有研究［8，10，26］發(fā)現(xiàn)，miR-146a 可通過靶向腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）與白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶1（interleukin-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）調(diào)控Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號通路的激活狀態(tài)，而TLR4、TRAF6、IRAK1 均為核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路的上游節(jié)點，且該通路可調(diào)控白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-10、IL-1β等眾多炎癥因子，因此miR-146a間接參與了調(diào)控炎癥因子的表達(dá)。鑒于miR-146a-5p 對巨噬細(xì)胞和炎癥通路的復(fù)雜調(diào)控作用，本研究認(rèn)為其在NEC 腸道炎癥中的調(diào)控同樣是較為復(fù)雜的。

miR-146a-5p 高表達(dá)與組織病理評級的相關(guān)性提示，NEC患兒出現(xiàn)miR-146a-5p高表達(dá)與腸道損傷嚴(yán)重程度相關(guān)，因此miR-146a-5p 高表達(dá)的患兒需進(jìn)行更積極的抗炎治療和更頻繁的影像學(xué)、實驗室檢查，以觀測病情進(jìn)展。然而在臨床上，對患者的早期診斷常依賴于對血、尿、糞等較易獲取的標(biāo)本中的miR-146a-5p 進(jìn)行檢測，而非腸道組織。在本研究中，我們未采集NEC 患兒的外周血，而新生小鼠的外周血量非常有限，不足以進(jìn)行miR-146a-5p 檢測。因此，在后續(xù)研究中或可通過其他方法（如提高miRNA 在外周血中的檢測靈敏度）檢測外周血中miR-146a-5p的表達(dá)，以期作為NEC 早期診斷或提示病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。

本研究尚存在一些不足之處：①樣本量較小。②采用的NEC 患兒腸道組織標(biāo)本存放時間較長，且取材時間間隔亦較長，使得miRNA 降解程度不一，進(jìn)而導(dǎo)致miRNA檢測可能存在誤差。

綜上所述，miR-146a-5p 的高表達(dá)與腸道組織結(jié)構(gòu)破壞程度和損傷范圍相關(guān)，提示miR-146a-5p參與了NEC的發(fā)生與發(fā)展，但具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。