亓照耀， 楊 帆， 呂孟可， 楊麗萍， 袁海燕， 閆民澤， 張慧娜

(河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450046)

中醫(yī)自古就對恐、腎、骨三者的關系有深刻認識。在《黃帝內經》中就已提出“腎主骨”理論，其中《素問·陰陽應象大論篇》曰：“腎生骨髓……其志為恐，恐傷腎”。恐能傷腎，影響腎先天之精氣[1]?！鹅`樞·本神》又載：“恐懼而不解則傷精，精傷則骨酸痿厥，精時自下。[2]”現代研究提示，恐懼應激可激活孕鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸，繼而影響孕鼠健康，表現出糖皮質激素(GC)水平升高[3]?？謧惺髸斐善溆啄曜惺笄橹靖淖?，對仔鼠的一般發(fā)育及神經發(fā)育造成不良影響[4，5]。但母代孕期恐懼應激導致的“腎精虧虛”是否影響子代骨的早期發(fā)育鮮見報道。

本研究從“恐傷腎，腎主骨”角度探討孕期恐傷刺激對56日齡仔鼠股骨發(fā)育和血清骨代謝指標I型膠原羧基端交聯肽(CTX-I)、骨源性堿性磷酸酶(BALP)和I型前膠原氨基端原肽(PINP)的改變，探索恐傷孕鼠對子代骨發(fā)育的影響，論證“恐傷腎虛致胎損”的中醫(yī)經典理論，揭示“胎損”在骨發(fā)育方面的表現及機制。本研究已通過河南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審查，倫理許可證號DWLL2018030017。

1 材料與方法

1.1 動物

7周齡Wistar大鼠40只，雌鼠25只，雄鼠15只，其中雄性270～320 g，雌性180～220 g，由北京維通利華實驗動物公司提供許可證號SCXK(京)2016-0006。實驗在河南中醫(yī)藥大學實驗動物中心進行，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度20 ℃±5℃、濕度40%±15%和12 h明暗循環(huán)。適應性喂養(yǎng)1周后，首先采用曠場實驗進行行為基線測試，選取基線水平一致且體格較強壯的雄鼠和雌鼠在晚20∶00進行合籠，第2天8∶00檢查是否有陰栓，若有則為受孕0.5 d，反之繼續(xù)合籠。將成功受孕的雌鼠20只按隨機數字表法分為對照組和模型組，所有雄鼠作為電擊鼠用于建立模型，所有仔鼠延續(xù)孕鼠分組飼養(yǎng)至56日齡。

1.2 主要試劑及儀器

CTX-I Elisa試劑盒(伊萊瑞特，E-EL-R1456c)；BALP Elisa試劑盒(伊萊瑞特，E-EL-R0113c)；PINP Elisa試劑盒(伊萊瑞特，E-EL-R1414c)；GC Elisa試劑盒(博士德，KE00022)；微型高速離心機(美國Labnet，C2500-R-230V)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE，ICV-450)；酶標儀(Molecular Devices，Flexstation 3)；熱電ICP電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(美國ARL，ICAP6300)；動物行為學分析軟件(ANY-maze)(美國Stoeling, Edition 1.0，上海軟隆科技有限公司)；大鼠行為學檢測設備(江蘇賽昂斯生物技術有限公司提供)。

1.3 建模方法

模型組運用旁觀電擊法建立妊娠期恐傷大鼠模型[5-7]，用于建立模型的交流電擊箱。交流電擊箱由透明有機玻璃組成，分為15 cm×15 cm×30 cm的9個小室，中間列3個小室為電擊室，兩側列6個小室為旁觀室。小室之間有機玻璃板上有若干直徑為1 cm小孔，在旁觀室靠近電擊室側有供攀爬逃離電擊的細鐵絲(電擊室無鐵絲)。旁觀孕鼠為逃避電擊攀爬在鐵絲上，通過聽、視、嗅等捕捉臨近被電擊鼠的恐懼信息，由此給孕鼠產生單純的恐懼心理刺激。建立模型具體操作如下：將電擊雄鼠、旁觀模型組孕鼠分別放入電擊箱相應的小室內，每2 min鳴響警報聲60 s，鳴響時段均勻給予瞬時20 mA電刺激10次，重復操作15次，每次總時30 min，每日2次，持續(xù)20 d。

1.4 指標檢測

1.4.1 曠場實驗 利用動物行為學分析軟件(ANY-maze)進行曠場實驗。對2組孕7 d、14 d和20 d的孕鼠及按隨機數表選取的56日齡仔鼠進行心理應激評價，測試時間為5 min。黑色曠場測試箱(100 cm×100 cm×45 cm)底面被分為25個正方形小格(20 cm×20 cm)。安靜環(huán)境下，抓住大鼠尾根尖1/3處提起，輕輕放入測試箱正中格，適應1 min后，記錄5 min內大鼠穿格次數(雙后肢穿過一格記1分)、直立次數(雙前肢離地直立一次記1分)、修飾次數和尿便次數。

1.4.2 血清生化指標和臟器指標檢測 模型組孕鼠在孕20 d時行尾靜脈取血，模型組56日齡仔鼠在行為學檢測實驗結束后，適度麻醉經腹主動脈取血，靜置30 min后3000r/min離心15 min取血清。冰面上快速剝離雙后肢股骨，在液氮速凍后存置于-80 ℃冰箱保存，所有實驗大鼠取材后采用斷頭法處死。采用ELISA法測定血清生化指標GC、CTX-I、BALP、PINP水平，按試劑盒推薦步驟操作。腎臟臟器系數的具體計算公式為：腎臟臟器系數=腎臟質量/體質量×100，即腎臟質量在每100 g體質量占比。

1.4.3 血清和骨鈣磷水平檢測 取股骨頭樣品進行磨細、過篩(0.25 mm篩)、稱量0.2 g裝入100 mL消煮管底部，加入硝酸5 mL、高氯酸2 mL，200 ℃消煮1 h至澄清，定容至50 mL待測。取血清樣品0.5～1.0 mL按上述方法處理制備待測液。采用ICP電感耦合等離子發(fā)射光譜儀檢測鈣磷水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 模型評價

表2示，與對照組比較，模型組孕鼠在孕7 d、孕14 d和孕20 d的曠場實驗水平得分、垂直得分均降低(P<0.05)。建模結束后，孕20 d GC水平顯著升高(P<0.05)。

表1 2組孕鼠孕7 d和14 d曠場實驗評分比較(分，

表2 2組孕鼠孕20天曠場實驗評分和GC水平比較(分，

2.2 仔鼠行為學與發(fā)育評價

表4示，模型組56日齡仔鼠曠場實驗水平得分、垂直得分均低于對照組(P<0.05)(表3)，體質量減輕，腎臟質量和臟器系數均降低(P<0.05)。

表3 2組仔鼠曠場實驗評分水平比較

表4 2組仔鼠體質量和腎臟發(fā)育情況比較

2.3 仔鼠股骨和骨鈣磷情況

表5示，與對照組比較，模型組56日齡仔鼠雙后肢股骨干重降低(P<0.05)，鈣磷含量也均降低(P<0.05)。

表5 2組仔鼠股骨發(fā)育和鈣磷水平比較

2.4 仔鼠血清鈣磷和骨代謝指標水平

表6示，與對照組比較，模型組56日齡仔鼠血清中鈣含量降低(P<0.05)，CTX-I的水平顯著升高(P<0.05)，BALP和PINP的水平均降低(P<0.05)。

表6 2組仔鼠血清鈣磷和骨代謝指標CTX-I、BALP、PINP水平比較

3 討論

近年來，情志因素對健康的影響受到越來越多的關注?！翱謧I”是中醫(yī)七情內傷的經典論述之一?！端貑枴り庩枒蟠笳撈酚涊d：“在臟為腎……在志為恐”，指出“恐”的情志活動與“腎”關系密切[1]?！饵S帝內經》也有“腎藏精”“腎主骨”“骨者髓之府”“腎生骨髓”等理論，認為腎與骨的生長發(fā)育密切相關[8]。腎在體合骨生髓，又稱“腎主骨”，骨的生長有賴于骨髓所養(yǎng)，若腎精不足，骨髓生化無源，則骨失所養(yǎng)，這些都表明“恐”與“骨發(fā)育”之間的關系密切。

本研究使用改進的旁觀電擊法建立孕期恐懼應激大鼠模型。建立模型時，旁觀鼠在恐懼心理狀態(tài)下攀爬箱體躲避電擊的同時，又可通過視、聽、嗅覺獲得恐懼信號，加強應激效果且避免大鼠遭受實質性傷害，其模型的重現性高，適合建立單純慢性恐懼心理應激模型[3]。慢性恐懼應激可致HPA軸過度激活,使血清中GC含量升高，可作為評價慢性應激程度的可靠指標。研究表明，恐傷孕鼠的HPA軸激活，促腎上腺皮質激素和GC水平均升高[3，4]。本研究結果表明，與空白組比較，模型組孕鼠行為學評價異常，GC水平升高，提示恐傷孕鼠模型建立成功。

腎主藏精，主生長發(fā)育。既往研究表明，恐傷孕鼠不僅對子代仔鼠的發(fā)育[3,9]、情志及空間學習等能力具有調控作用[7,10]，而且影響腦部神經遞質水平[5]。本研究發(fā)現，模型組56日齡仔鼠出現了體質量減輕和行為學異常，提示恐懼應激影響了子代發(fā)育和情志。從中醫(yī)理論來講，母孕期受恐，傷及其腎，致使腎精不足，“先天有虧，子氣應之”，子所蘊先天之精氣不足影響其生長發(fā)育。本研究發(fā)現，仔鼠的腎臟質量和股骨干重減輕，臟器系數降低，提示母鼠孕期恐傷腎導致的腎精虧虛影響子代的正常生長和股骨的發(fā)育。

骨骼是代謝活躍的組織，PINP和CTX-I是敏感的骨形成及骨吸收指標[11，12]。鈣、磷是骨礦物質中最基本的元素，在骨基質鈣化過程中具有重要作用，其減少影響骨骼的發(fā)育[13]。正常情況下機體通過血鈣與骨鈣的交換來維持血鈣相對穩(wěn)定，當血鈣濃度升高時鈣可向骨沉積，當血鈣濃度降低時骨鈣會轉移到血液中導致骨鈣流失，可能引起骨代謝紊亂[14，15]。本研究發(fā)現，模型組仔鼠血清鈣含量降低，骨中鈣磷含量也出現降低，提示模型組仔鼠的股骨質量減輕的原因可能與骨鈣磷減少有關。

骨轉換是成骨細胞和破骨細胞等緊密合作的骨骼代謝動態(tài)過程[16，17]。骨代謝生化指標是骨組織分解與合成的中間產物，相比骨密度檢測更靈敏。骨轉換生化指標比較敏感，是評價骨早期發(fā)育的重要方法[18，19]。骨基質蛋白90%以上是Ⅰ型膠原，PINP是骨形成中Ⅰ型原膠原代謝成膠原的中間產物，可敏感而特異性地反映成骨細胞活性，在應用中有重要意義[20]。CTX-I是骨吸收過程中Ⅰ型膠原降解產物，可特異性地反映破骨細胞活性[21，22]。BALP由成骨細胞分泌，可以促進骨基質鈣化。舊骨被吸收，鈣磷釋放至血液，在新骨重建時BALP促進血中鈣磷重新沉著于新建的骨組織。本研究發(fā)現，模型組仔鼠血清CTX-I升高，PINP和BALP出現降低，表明模型組仔鼠的骨吸收速度高于骨生成速度，這提示骨代謝平衡出現異常，骨流失增強。而且骨鈣化速度也減慢，可能是為了進一步彌補血鈣流失。模型組仔鼠的骨吸收增快，可能也是股骨質量降低的主要原因，進而影響了骨發(fā)育進程。恐懼刺激可能是通過影響腎臟發(fā)育進而引起骨發(fā)育和代謝的紊亂，但其具體作用機制仍待進一步探索。

綜上所述，恐傷孕鼠的子代不僅情志認知改變，而且骨代謝也出現紊亂，腎精虧虛是造成這種紊亂的原因之一。這為“腎主骨”“恐傷腎”的中醫(yī)經典理論提供了客觀實驗依據，也為中藥防治腎經虧虛導致的骨發(fā)育異常提供參考。