龔頻，劉萌，裴舒亞，楊倩，楊文娟，陳福欣

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021）（2.西安科技大學化學與化工學院，陜西西安 710054）

隨著人民生活水平的提升及生活方式的改變，糖尿病患者的數(shù)量逐年增加，且有極高的患病率、致殘率和死亡率，已成為嚴重威脅人類健康的疾病之一。最新數(shù)據(jù)表明，截至到2015年全球有超過4億1500萬人患有糖尿病（Diabetic Mellitus，DM），預計在2040年將增加到6億4200萬人，中國DM患者人數(shù)最多為1億960萬[1]。流行病學的調查結果顯示，在中國成年人中，DM總患病率為10.9%[2]。糖尿病的病因十分復雜，迄今為止尚不清楚，它可以引起心、腦、肝、腎、胰臟等多種器官的損傷，嚴重危害人類的健康。

重金屬鎘（Cadmium，Cd）被廣泛的應用于染料、電池等行業(yè)，但鎘的毒性較大，被國際癌癥機構列為Ⅰ類致癌物。鎘的生物半衰期為10～30年，易于在生物體內富集，特別是在肝臟、腎臟以及骨骼中富集，從而引起機體出現(xiàn)健康損害甚至中毒。日常生活中鎘暴露主要來自于食物、水源以及香煙燃燒[3,4]。流行病學研究表明，鎘暴露與糖尿病的發(fā)生發(fā)展存在密切的關聯(lián)[5-7]，但是鎘暴露對糖尿病狀態(tài)下的胰臟的損傷作用報道較少。同時，研究顯示，高血糖所致的氧化應激是導致糖尿病胰島素抵抗的原因之一。高血糖使機體內部血糖持續(xù)增高，誘導氧化應激反應，大量活性氧簇（ROS）被聚積，胰臟處于氧化應激狀態(tài)，易激活多個損傷機制而破壞其結構和功能[8]。

目前，關于糖尿病的治療主要包括注射胰島素及口服降糖藥，如磺酰脲類，雙胍類，α-葡萄糖苷酶抑制劑和格列奈類，但糖尿病患者長期服用會使機體產(chǎn)生耐藥性且對肝臟，腎臟等器官造成損傷[9]。與化學藥物相比，傳統(tǒng)中藥大多來源于自然界，且一般都含有多種藥理作用，很多中藥材有藥食同源的功效，對機體的毒副作用相對較低，因此，從天然產(chǎn)物中篩選和發(fā)現(xiàn)降血糖活性成分成為糖尿病新藥研發(fā)的重要方向[10,11]。

黃芪是蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，性味微溫、甘，在中國被廣泛用于治療消渴癥及其并發(fā)癥，黃芪具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、托毒生肌等功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》有云：“主諸熱黃疸，腸澼泄痢，逐水，下血閉，惡瘡疽蝕火瘍?！薄｜S芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）是其重要的功效成分之一。黃芪甲苷的主要藥理作用包括增強免疫力、抗炎、抗氧化、抗病毒等，在臨床上被用于治療腎病、糖尿病、心腦血管等疾病[12]，已有研究表明黃芪甲苷可以降低血糖水平，改善胰島素抵抗，降低氧化應激及炎癥反應，從而起到保護作用[13,14]，但是黃芪甲苷對鎘誘導的糖尿病小鼠的胰臟損傷的保護作用尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雄性昆明小鼠[許可證號：SCXK(陜)2017-003]，購自西安交通大學實驗動物中心；黃芪甲苷購于源葉科技有限公司，純度大于99%，其結構式如圖1所示。氯化鎘（CdCl2）購自天津市福晨化學試劑廠，生理鹽水購自西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純。

圖1 黃芪甲苷的結構式Fig.1 Structure of astragaloside IV

1.2 實驗動物與模型建立

雄性昆明小鼠50只，體重20.00±2.00 g，實驗前適應性飼養(yǎng)3～5 d，自由取食飲水。將小鼠隨機分為5組，每組10只。模型構建參考本實驗之前的實驗方法[15]，具體如表1所示。

表1 糖尿病小鼠模型構建方法Table 1 Construction method of diabetic mouse model

空白組每天給予普通飼料，同時，腹腔注射0.9%的生理鹽水。除空白組以外，模型組和保護組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，同時，給予腹腔注射1.00 mg/kg氯化鎘，構建糖尿病小鼠模型。每周檢測小鼠空腹血糖變化。處理8周后，當模型組和保護組小鼠血糖≥11.10 mmol/L時，認為模型構建成功。

實驗用的高脂高糖飼料所用的配方為：普通飼料粉末40.00%～50.00%、脂肪（熟豬油）20.00%～25.00%、食用白砂糖20.00%、雞蛋8.00%～12.00%、食用鹽<5.00%。

模型構建成功后，保護組胃飼不同劑量的黃芪甲苷，分別為低劑量組：20.00 mg/kg，中劑量組40.00 mg/kg，高劑量組60.00 mg/kg每日上午給藥1次，模型組和空白組均灌胃0.9%的生理鹽水，連續(xù)處理4周。

整個飼養(yǎng)過程中保持溫度、光照、濕度等環(huán)境條件平行，每日供應飲食、飲水總量一致，末次處理前，禁食12 h，斷頸處死，取新鮮胰臟組織，生理鹽水沖洗干凈后，于-80 ℃冷凍保存，用于檢測鎘致糖尿病小鼠胰臟組織的指標變化。

1.3 氧化損傷指標測定

胰腺組織加入適量冷裂解液研磨勻漿，制備成10%的組織勻漿，3000 r/min低溫離心10 min后取上清液，蛋白測定采用考馬斯亮藍法、丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法[6]測定、組織中的酶抗氧化劑活性SOD用聯(lián)苯三酚自氧化法[12]測定、用DTNB（5,5’-二硫代雙，2-硝基苯甲酸）法[14]測定還原型谷胱甘肽（GSH）的生成量。

1.4 胰臟超微結構觀察

胰臟組織用戊二醇預固定后，用1%的鋨酸進行后固定，常規(guī)乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618浸透、包埋、聚合，半薄切片（厚度1 μm）定位，超薄切片（厚度50～70 nm），醋酸鈾和枸櫞酸鉛電子染色，Hitachi7500型透射電子顯微鏡觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。計量資料組間比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計學上p<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 2型糖尿病（T2DM）小鼠模型的確認

根據(jù)課題組之前的方法構建糖尿病小鼠模型，如表2所示，鎘聯(lián)合高脂高糖處理8周，除空白組以外，其他四組的血糖均大于11.10 mmol/L，表明糖尿病小鼠模型構建成功；給予黃芪甲苷4周處理后，結果表明不同劑量黃芪甲苷處理能夠顯著的降低小鼠血糖值（p<0.05，p<0.01），表明黃芪甲苷對糖尿病小鼠具有一定的保護作用。謝春英[16]研究了黃芪甲苷對高血糖小鼠的降血糖作用，結果顯示黃芪甲苷具有降血糖作用，這與本實驗結果一致。

表2 不同處理時長不同組別血糖值Table 2 Blood glucose levels for different treatment periods

2.2 黃芪甲苷對糖尿病小鼠胰臟氧化指標的影響

MDA是ROS生成脂質過氧化的終末產(chǎn)物，可加速生物膜損傷，其含量能間接反映膜系統(tǒng)受損程度和細胞受自由基攻擊的程度，被認為是評估氧化應激的良好標記物[17]。如圖2所示，空白組MDA的含量為0.50 mmol/L protein，糖尿病小鼠MDA含量為空白組MDA含量的1.90倍，顯著高于空白組MDA的含量（p<0.01）。相比于糖尿病小鼠組，黃芪甲苷低劑量保護組、中劑量保護組、高劑量保護組MDA含量分別為糖尿病小鼠組MDA含量的82.10%（p<0.05），68.40%（p<0.01）、58.90%（p<0.01），呈劑量依賴型趨勢。鎘雖然不是氧化還原金屬元素，但是大量文獻報道鎘能夠加劇體內的氧化應激狀態(tài)，本研究結果表明，鎘誘導的糖尿病小鼠胰臟的脂質過氧化反應增強，MDA含量增多，導致細胞代謝紊亂，最終引起胰臟功能失調。攝入黃芪甲苷能夠減輕小鼠胰臟的脂質過氧化程度，減少MDA的含量，保護胰臟免受自由基的損傷。李竹青[18]研究了黃芪甲苷對糖尿病大鼠早期腎臟損傷的保護作用，結果顯示不同劑量黃芪甲苷保護組MDA含量均顯著降低。說明了黃芪甲苷可以降低MDA的含量，緩解氧化損傷，從而起到保護作用。

圖2 黃芪甲苷對糖尿病小鼠MDA水平的影響Fig.2 Effects of astragaloside IV on MDA levels in diabetic mice

如圖3所示，空白組的SOD含量為1.12 U/mg protein，糖尿病小鼠組SOD含量僅為空白組的48.10%，顯著低于空白組（p<0.01）。與糖尿病組相比，黃芪甲苷保護組中SOD活性大大提升，其中，中劑量保護組、高劑量保護組SOD活性分別達到了糖尿病組的1.52倍（p<0.05）、1.72倍（p<0.01）。體內SOD的活性對于維持機體氧化-還原的動態(tài)平衡至關重要，SOD活力的下降會導致脂質過氧化反應的增強，結果表明，鎘誘導的糖尿病小鼠模型中，小鼠胰臟SOD活性下降，自由基過度產(chǎn)生，脂質過氧化反應增強，從而損傷了胰臟，黃芪甲苷的保護，能夠緩解機體SOD水平的下降，提高胰臟的抗氧化能力，減少胰臟的損傷。韓冬等[19]研究黃芪甲苷對實驗性糖尿病大鼠肝臟組織的保護作用，發(fā)現(xiàn)中、高劑量黃芪保護組SOD活性均高于模型組。提示黃芪甲苷對實驗性糖尿病大鼠具有保護作用，其作用機制可能與其能有效改善肝臟組織抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷有關，與我們的研究結果一致，說明黃芪甲苷能夠緩解機體SOD水平的下降，提高機體抗氧化能力，緩解機體損傷。

圖3 黃芪甲苷對糖尿病小鼠SOD水平的影響Fig.3 Effects of astragaloside IV on SOD levels in diabetic mice

如圖4所示，糖尿病小鼠GSH含量低于空白組（p<0.05），僅為空白組的44.40%，黃芪甲苷保護組GSH的含量明顯高于糖尿病小鼠，呈劑量依賴趨勢，高劑量保護組的效果最明顯，為糖尿病小鼠組的2.00倍（p<0.01）。實驗表明，鎘在小鼠胰臟中聚集，導致大量自由基的產(chǎn)生，抑制了機體的抗氧化水平，導致氧化應激損傷，GSH的含量作為衡量細胞氧化還原狀態(tài)的一個重要指標，可以通過直接供H+拮抗氧自由基毒性，清除體內的氧自由基，減少胰臟的氧化損傷[20]。

圖4 黃芪甲苷對糖尿病小鼠GSH水平的影響Fig.4 Effects of AstragalosideIV on GSH levels in diabetic mice

在機體正常的代謝過程中，氧化還原處于動態(tài)平衡。鎘暴露聯(lián)合高脂高糖處理誘導小鼠糖尿病發(fā)生，加劇了其氧化應激反應，產(chǎn)生大量氧氮自由基，攻擊脂質、蛋白質和DNA等大分子，產(chǎn)生MDA等脂質過氧化物、蛋白質羰基化產(chǎn)物（PCO）等，破壞細胞膜系統(tǒng)，損傷胰臟的抗氧化系統(tǒng)，破壞其正常的生理功能。SOD和GSH能夠清除自由基，減少對胰臟的損傷。黃芪甲苷是一種羊毛酯醇形的四環(huán)三萜皂苷，是黃芪藥材的主要有效成分之一。Cao等[21]報道黃芪甲苷可通過內源性抗氧化劑清除活性氧。黃芪甲苷處理可降低MDA含量，提高谷胱甘肽過氧化物酶和SOD水平。Lv等[22]報道黃芪甲苷可以降低2型糖尿病小鼠肝臟中的糖原磷酸酶和葡萄糖-6-磷酸酶水平，降低血糖和甘油三酯水平，改善胰島素抵抗。因此，黃芪甲苷通過清除自由基，減少自由基對胰臟的損傷，同時通過改善胰島素抵抗，維持胰島素與胰高血糖素分泌的平衡，提高胰島素的分泌質量，防止因血糖水平不穩(wěn)定而導致機體代謝紊亂，胰臟受到損傷而進入惡性循環(huán)。

2.3 黃芪甲苷對糖尿病小鼠胰臟超微結構的影響

如圖5所示，與空白組比，糖尿病小鼠組胰島細胞中的分泌顆粒體密度顯著減少、線粒體體密度也相應減少，胞核及核內染色質幾乎完全溶解消失。與糖尿病小鼠組相比，黃芪甲苷組能夠顯著對抗鎘聯(lián)合高脂高糖所致胰島細胞的損害，分泌顆粒體密度、線粒體體密度明顯增高，表明鎘聯(lián)合高脂高糖對小鼠胰臟亞細胞結構造成了損傷，而黃芪甲苷的作用能夠在一定程度上緩解這種變化。黃芪甲苷可顯著提高實驗性糖尿病模型大鼠胰島素分泌水平、ISI，降低HOMA-IR，提示黃芪甲苷對實驗性糖尿病大鼠胰腺組織具有保護作用。肖徐陽[23]研究了黃芪甲苷對糖尿病小鼠肝臟、胰臟組織不同程度損傷的緩解作用，結果顯示，黃芪甲苷保護組小鼠肝臟、胰臟組織損傷均得到不同程度的緩解，說明黃芪甲苷能夠顯著改善糖尿病小鼠損傷。

圖5 黃芪甲苷對糖尿病小鼠胰臟保護作用研究Fig.5 Protective effect of astragaloside IV on pancreas of diabetic mice

3 結論

本研究實驗結果證實，糖尿病的發(fā)病機制與氧化應激有著密切的聯(lián)系，黃芪甲苷可能是通過清除過量產(chǎn)生的自由基，減少氧化應激對胰臟的損傷，從而起到一定的保護作用。但糖尿病的作用機制非常復雜，有待進一步研究。