林靈，王瑜，楊娟*，李立郎，安正斌，解春芝，趙敏，楊小生

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025）（2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550014）（3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550014）（4.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇徐州 221018）（5.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025）

失眠癥是指無法得到正常睡眠的一類病癥，它會(huì)引起反應(yīng)遲緩、疲倦不堪、煩躁不適、頭暈、注意力難以集中，嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致精神失常、焦慮、抑郁等神經(jīng)功能紊亂以及心腦血管系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等疾病[1]。西醫(yī)學(xué)治療失眠多采用巴比妥、苯二氮卓等鎮(zhèn)靜安眠藥，但這些藥物具有易疲乏嗜睡，頭暈反胃等不良反應(yīng)，長期服用會(huì)有成癮性、阻抑呼吸系統(tǒng)、損害認(rèn)知功能等副作用[2]，而安神類中藥具有臨床療效確切、副作用小等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于治療失眠[3]。天麻（Gastrodia elataBl.）為蘭科多年生異養(yǎng)型植物[4]，天麻常作為藥膳原材料，是保健的優(yōu)品。貴州省是全國中藥資源最豐富的省區(qū)之一，貴州天麻中的水分含量、二氧化硫殘留量、浸出物均符合2015版《中國藥典》，且浸出物遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)[5]，品質(zhì)較佳。天麻的活性極其豐富，研究發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥[6]、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[7]、調(diào)節(jié)腸道菌群[8]等功效，并且對人體免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面均能發(fā)揮較好的藥理活性[9,10]。天麻酵素是新鮮天麻經(jīng)益生菌發(fā)酵而成，相較于傳統(tǒng)工藝制備的天麻粉，無需蒸制、烘干、整形回汗（3～4次）、粉碎等繁瑣工序，可減少能耗，降低成本；其次，通過微生物發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生一系列風(fēng)味代謝產(chǎn)物，能有效改善天麻不愉悅風(fēng)味，且更方便食用；此外，發(fā)酵后，不僅能將原本物質(zhì)中較難利用的活性物質(zhì)進(jìn)行降解，還會(huì)生成豐富的小分子功能成分，更利于人體吸收與利用[11]。但相較于工藝繁雜的天麻粉，目前天麻酵素鎮(zhèn)靜催眠功效尚不明確。因此，本文分析了天麻酵素的理化指標(biāo)并研究以失眠小鼠為對象，通過探究天麻酵素對失眠模型小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及氧化應(yīng)激水平的影響，為其鎮(zhèn)靜催眠的作用效果提供理論依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步探究天麻酵素改善睡眠的作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級KM雄性小鼠，體質(zhì)量25±2 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：211002300051011，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001，飼養(yǎng)條件為濕度60%±5%，溫度25±1 ℃均給予小鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和自然晝夜節(jié)律光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，本文所做實(shí)驗(yàn)均獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

天麻由貴州省德江縣綠通天麻發(fā)展有限公司提供；發(fā)酵劑：貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，主要的優(yōu)勢菌株為：酵母菌，乳酸菌，醋酸菌；棗仁安神液購自北京同仁堂股份有限公司；對氯苯丙氨酸（PCPA）購自美國Sigma公司；IL-1β試劑盒（批號：2008M-0040M2）；5-HT試劑盒（批號：2008M-0443M2）、GABA試 劑 盒（批 號：2008M-0442M2）均購自上海瑞番生物科技有限公司；SOD測試盒（批號：A001-1）、MDA測試盒（批號：A003-1）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本HITICHI公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；YL288-0-100酒精計(jì)，貴州慕為美科技有限公司；RM-255溫度計(jì)，貴州慕為美科技有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，貴州慕為美科技有限公司；ZZ-6小鼠自主活動(dòng)測試儀，成都泰盟科技有限公司；KG-PB-936打漿機(jī)，上海達(dá)瑞寶公司；BS-210S型電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；VICTOR Nivo酶標(biāo)儀，珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司；SPX-100生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 天麻酵素的制備

新鮮天麻清洗干凈后打漿，裝入發(fā)酵壇內(nèi)，按照其重量1:2加入沸水?dāng)嚢枋旎?，按照其總質(zhì)量的10%添加白糖，攪拌使白糖完全溶化，待溫度降至50～60 ℃時(shí)，按照其總重量的0.02%添加纖維素酶，待溫度降至30～40 ℃時(shí)，按其總重量的0.03%添加酵素發(fā)酵劑，采用保鮮膜密封發(fā)酵壇在微需氧條件下發(fā)酵10 d后，去掉保鮮膜換成紗布進(jìn)行有氧發(fā)酵，發(fā)酵到60 d，結(jié)束發(fā)酵，完成天麻酵素的制備。

1.4.2 天麻酵素理化指標(biāo)測定

1.4.2.1 天麻酵素的pH和酒精度測定

pH測定：吸取天麻酵素20 mL于燒杯中，將pH計(jì)探測頭放入燒杯測定pH值。

酒精度測定：取100 mL天麻酵素于蒸餾瓶中并加入100 mL蒸餾水，裝上冷凝器和接收器，緩緩加熱蒸餾，收集約95 mL餾出液時(shí)取下，加水定容至100 mL，搖勻備用。用酒精計(jì)和溫度計(jì)進(jìn)行測量，記錄測得的溫度和酒精計(jì)示值，查GB 5009.225-2016中的附錄B，計(jì)算其酒精度。

1.4.2.2 天麻酵素中對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛的含量測定

色譜條件與方法：Syncronis C18色譜柱(4.60 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃；流量1 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；檢測波長220 nm；流動(dòng)相A為0.05%（體積分?jǐn)?shù)，下同）磷酸溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～10 min，B為10%；10～15 min，B由10%升至20%；15～20 min，B由20%升至25%；20～40 min，B由25%升至45%。將天麻酵素用0.45 μm微孔濾膜過濾后得樣品溶液[12]。

1.4.2.3 天麻酵素中γ-氨基丁酸的含量測定

色譜條件與方法：色譜柱為標(biāo)準(zhǔn)分析陽離子型交換樹脂（LCAK07/Li）；進(jìn)樣量50 μL；檢測波長：570 nm；輸液泵壓力0～4.20 MPa；流流速：洗脫泵0.45 mL/min；茚三酮衍生泵0.25 mL/min；分離柱溫度為37 ℃，反應(yīng)器溫度為130 ℃。準(zhǔn)確稱量1.02 g磺基水楊酸至100 mL容量瓶中并定容，配制成1%的磺基水楊酸溶液；取天麻酵素樣品1 mL分別加入9 mL磺基水楊酸溶液，震蕩均勻，10000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后放入全自動(dòng)氨基酸分析儀中檢測[13]。

1.4.3 分組、造模及給藥

將70只KM小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，每組10只，依次為空白對照組、模型組、棗仁安神液組2.40 mL/kg（陽性對照組1，蒸餾水配制）、天麻粉組0.48 g/kg（陽性對照組2，蒸餾水溶解配制）、天麻酵素低（0.10 g/kg）、中（0.30 g/kg）、高（0.49 g/kg）劑量組。除空白組外，其余各組小鼠每天上午8:00～9:00腹腔注射PCPA混懸液（350 mg/kg）（生理鹽水溶解，pH為7～8），1次/d，連續(xù)注射3 d，觀察小鼠行為。3 d后，與空白組比較，其他組小鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂、白天活動(dòng)不停、毛發(fā)雜亂、興奮性增強(qiáng)、攻擊性增強(qiáng)、大便灰白等顯著的行為學(xué)改變，表明失眠模型制備成功[14]。造模后進(jìn)行灌胃，給藥容積為0.1 mL/10 g，正常對照組與模型組按比例灌服同體積生理鹽水。各組小鼠上午8:00～9:00灌胃給藥1次，下午16:00～17:00灌胃給藥1次，2次/d，連續(xù)7 d。

1.4.4 天麻酵素對小鼠體重和自主活動(dòng)的影響

在實(shí)驗(yàn)前、灌胃7 d時(shí)分別稱定每只小鼠體重。在第5 d給藥60 min后，將小鼠放入自主活動(dòng)記錄儀小室內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境3 min，用自主活動(dòng)儀連續(xù)記錄5 min內(nèi)小鼠活動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)（前肢向上抬舉次數(shù)）。

1.4.5 天麻酵素對失眠模型小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及氧化應(yīng)激水平的影響

各組小鼠灌胃給藥7 d后，將其斷頭處死，迅速取出小鼠腦組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后稱質(zhì)量，加生理鹽水制備10%的腦組織勻漿。4 ℃下3500 r/min離心10 min（離心半徑10 cm）后取上清液，于-20 ℃或-80 ℃低溫保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定各組小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、GABA、IL-1β的含量變化，以MDA含量和SOD活性評價(jià)氧化應(yīng)激水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，p<0.05或p<0.01為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均以±SD表示，用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 天麻酵素理化指標(biāo)分析

發(fā)酵60 d天麻酵素基本理化指標(biāo)包括pH和酒精度，特征理化指標(biāo)包括γ-氨基丁酸、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛。QB/T 5232-2018標(biāo)準(zhǔn)中要求植物酵素pH在4.50以內(nèi)，酒精度在0.50 g/100 g以內(nèi)，而天麻酵素的pH和酒精度分別為3.51、0.36 g/100 g，符合標(biāo)準(zhǔn)中所要求的植物酵素基本指標(biāo)范圍。特征指標(biāo)中，γ-氨基丁酸是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有普遍的抑制作用[15]，對羥基苯甲醇是一種潛在的抗失眠藥物，其衍生物可逆轉(zhuǎn)對氯苯丙氨酸（PCPA）引起的失眠[16]，在天麻酵素中，γ-氨基丁酸含量為0.48 mg/kg，是QB/T 5232-2018標(biāo)準(zhǔn)中要求（0.03 mg/kg以上）的16倍，對羥基苯甲醇的含量為6.59 g/100 g，對羥基苯甲醛的含量為0.13 g/100 g。

表1 發(fā)酵60 d天麻酵素理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 1 Results of physical and chemical indexes of Gastrodia elata fermentation for 60 days

2.2 天麻酵素對小鼠體重的影響

各組小鼠體重變化如圖1所示，圖中所示的3 d為造模結(jié)束時(shí)間，10 d為給藥7 d的時(shí)間，造模3 d后與造模前（1 d）相比，各組小鼠體重雖有下降，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是因造模結(jié)束后，模型組小鼠晝夜節(jié)律紊亂、皮毛蓬亂無澤、攻擊性增強(qiáng)，白天不停走動(dòng)，小鼠由于失眠體重減少；給藥7 d后與造模結(jié)束（3 d）相比，各組小鼠體重均顯著性增加（p<0.01），是因給藥后，小鼠狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，白天活動(dòng)減少，睡眠時(shí)間延長，小鼠體重有所提升。

圖1 各組小鼠體重變化圖Fig.1 Body weight changes of mice in each group

2.3 天麻酵素對小鼠自主活動(dòng)的影響

睡眠是涉及多系統(tǒng)的復(fù)雜生理過程[17]?？赏ㄟ^小鼠的自主活動(dòng)情況來反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)，活動(dòng)次數(shù)減少代表中樞神經(jīng)系統(tǒng)被抑制，活動(dòng)次數(shù)增加代表中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮[18]。由表2可知，模型組小鼠的活動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)與空白組相比差異顯著（p<0.05），表明小鼠失眠模型建立成功；而棗仁安神液組（陽性對照組1）、天麻粉組（陽性對照組2）、天麻酵素高、中、低劑量組與模型組相比，小鼠的活動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)均有所減少，活動(dòng)時(shí)間分別減少10.50 s、11.00 s、13.00 s、14.63 s、4.50 s，站立次數(shù)分別減少10.87次、10.50次、10.62次、9.12次、9.35次，與模型組相比均差異顯著（p<0.05），說明天麻酵素與天麻粉[19]、棗仁顆粒[20]一樣，具有一定的鎮(zhèn)靜效果和明顯抑制小鼠自發(fā)活動(dòng)的作用。

表2 各組小鼠自主活動(dòng)相關(guān)指標(biāo)測定結(jié)果Table 2 Determination results of autonomic activity related indexes of mice in each group (x±s, n=10)

2.4 天麻酵素對失眠模型小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

失眠是一種由眾多神經(jīng)遞質(zhì)參與的神經(jīng)調(diào)節(jié)過程[21]。失眠患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮和抑制的平衡被破壞時(shí)會(huì)引起腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的改變[22]，其中相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)有5-羥色胺（5-HT）[23]、γ-氨基丁酸（GABA）[24]、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）[25]等，而腦組織是5-HT、GABA、IL-1β等神經(jīng)遞質(zhì)的共同主要來源[26]，因此選擇腦組織作為本研究的對象。

由表3可知，模型組與空白組相比，小鼠腦組織內(nèi)5-HT、GABA、IL-1β含量存在顯著性差異（p<0.01），表明小鼠失眠模型建立成功。而棗仁安神液組（陽性對照組1）、天麻粉組（陽性對照組2）、天麻酵素高、中、低劑量組與模型組相比都能增加小鼠腦組織內(nèi)5-HT、GABA、IL-1β含量，小鼠腦組織內(nèi)5-HT含量分別增加53.06 pg/mL、37.95 pg/mL、50.62 pg/mL、49.51 pg/mL、46.77 pg/mL，與模型組相比均差異顯著（p<0.05）；小鼠腦組織內(nèi)GABA含量分別增加4.78 ng/mL、3.66 ng/mL、5.47 ng/mL、5.15 ng/mL、3.63 ng/mL，與模型組比均差異極顯著（p<0.01）；小鼠腦組織內(nèi)IL-1β含量分別增加19.44 ng/L、17.90 ng/L、17.82 ng/L、26.64 ng/L、8.45 ng/L，其中，棗仁安神液組、天麻粉組、天麻酵素高劑量組與模型組相比差異顯著（p<0.05）、天麻酵素中劑量組與模型組相比差異極顯著（p<0.01）、低劑量組對比IL-1β含量雖有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且天麻酵素高劑量組小鼠腦組織內(nèi)GABA含量比天麻粉組增加1.81 ng/mL，與天麻粉組相比差異顯著（p<0.05）。卞勇等[27]發(fā)現(xiàn)樂眠膠囊具有治療失眠的功效，且百樂眠膠囊高劑量組使小鼠腦組織內(nèi)GABA含量提升34.92%、中劑量組使小鼠腦組織內(nèi)5-HT含量提升11.89%，而天麻酵素高劑量組（202.59%）所提升GABA含量的是其6倍，中劑量組（32.9%）所提升5-HT含量的是其2倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天麻酵素能提高小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量，和天麻粉[28]、蘇格木勒-3湯[14]一樣具有相同功效，而且給予天麻酵素治療后，各劑量組小鼠晝夜節(jié)律有所好轉(zhuǎn)，白天能較安靜入睡，行為活動(dòng)趨于正常。

表3 天麻酵素對失眠模型小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響Table 3 Effects of Gastrodia elata Bl. ferment on the content of neurotransmitters in brain tissue of mice with insomnia model (x±s, n=10)

2.5 天麻酵素對失眠模型小鼠腦組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

氧化應(yīng)激反應(yīng)是指在體內(nèi)氧化平衡失調(diào)的情況下自由基增加導(dǎo)致的各類蛋白酶水平增高、中性粒細(xì)胞炎性浸潤等一系列負(fù)面反應(yīng)[29]，超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）能較為全面地反映氧化應(yīng)激反應(yīng)綜合水平。腦部對氧化與抗氧化反應(yīng)比較敏感，并且SOD和MDA也被發(fā)現(xiàn)在睡眠-覺醒節(jié)律過程中起到一定的作用，當(dāng)鼠腦組織內(nèi)SOD活性降低、MDA含量增加時(shí)，會(huì)出現(xiàn)失眠癥狀[30]。

由表4可知，模型組與空白組相比，小鼠腦組織內(nèi)SOD活性與MDA含量存在顯著性差異（p<0.05），表明小鼠失眠模型建立成功。而棗仁安神液組（陽性對照組1）、天麻粉組（陽性對照組2）、天麻酵素高、中劑量組與模型組相比小鼠腦組織內(nèi)SOD活性均有所提高，分別提高29.47%、9.51%、13.46%、17.84%，與模型組相比均差異顯著（p<0.05）。而棗仁安神液組（陽性對照組1）、天麻粉組（陽性對照組2）、天麻酵素高、中、低劑量組與模型組相比小鼠腦組織內(nèi)MDA含量均有所降低，分別降低20 U/mg prot、4.50 U/mg prot、16.50 U/mg prot、24.20 U/mg prot、20.90 U/mg prot，其中棗仁安神液組、天麻酵素高、中、低劑量組與模型組相比差異顯著（p<0.05）、天麻粉組差異不顯著。韓金美等[14]發(fā)現(xiàn)蘇格木勒-3湯具有改善睡眠功效，且蘇格木勒-3湯低劑量組使大鼠腦組織內(nèi)MDA含量降低了7.09%，而天麻酵素低劑量組降低的小鼠腦組織內(nèi)MDA含量（15.69%）是其2倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天麻酵素可通過調(diào)節(jié)小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平來調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化能力而達(dá)到改善睡眠的效果。

表4 天麻酵素對失眠模型小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響Table 4 Effects of Gastrodia elata Bl. ferment on oxidative stress level of brain tissue in mice with insomnia model (x±s, n=10)

3 結(jié)論

本文通過分析天麻酵素理化指標(biāo)并研究天麻酵素對失眠模型小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)天麻酵素中γ-氨基丁酸含量為0.48 mg/kg，是QB/T 5232-2018標(biāo)準(zhǔn)中要求的16倍，對羥基苯甲醇的含量為6.59 g/100 g，對羥基苯甲醛的含量為0.13 g/100 g；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天麻酵素能調(diào)節(jié)小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量以及氧化應(yīng)激水平，天麻酵素高、中劑量組與模型組相比均能增加小鼠腦組織中5-HT、GABA、IL-1β含量、提高SOD活性、降低MDA含量，5-HT分別增加50.62 pg/mL、49.51 pg/mL，GABA分別增加5.47 ng/mL、5.15 ng/mL，IL-1β分別增加17.82 ng/L、26.64 ng/L，SOD活性分別提高13.46%、17.84%，MDA含量分別降低12.39%、18.17%，且與模型組相比均有顯著性差異（p<0.05）；天麻酵素高劑量組與天麻粉組相比小鼠腦組織內(nèi)GABA含量顯著增加1.81 ng/mL，差異顯著（p<0.05）。因此，相較于工藝繁瑣的天麻粉，天麻酵素同樣具有鎮(zhèn)靜催眠功效，經(jīng)益生菌發(fā)酵的天麻酵素，產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物更利于消化吸收，且風(fēng)味佳、食用方便、能耗低，可為天麻的開發(fā)利用提供新途徑。同時(shí)，該研究可為后期基于代謝組學(xué)及腸道菌群探討天麻酵素鎮(zhèn)靜催眠作用機(jī)制提供有效的理論和有效數(shù)據(jù)支撐，并為治療失眠提供新思路。