王麗娟，李一唯，楊立波，嚴(yán)寧，王浩，賈紹斌*

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川 750004）（2.銀川市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，寧夏銀川 750011）（3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川 750004）（4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心，寧夏銀川 750081）（5.國家衛(wèi)生健康委員會(huì)代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004）

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種與脂質(zhì)代謝障礙有關(guān)的、主要累及大、中動(dòng)脈的全身性疾病，病變特征是血液中脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜沉積并引起內(nèi)膜發(fā)生壞死、斑塊形成、纖維化病理損害，伴有顯著升高的血漿總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）含量。AS是冠心病、腦梗死及外周血管病的主要病變基礎(chǔ)之一[1]。心血管疾病是我國目前死亡率最高的疾病，占居民死亡構(gòu)成的40%以上，并且仍處于上升階段，迫切需要豐富安全、有效的干預(yù)策略與手段[2]。

近年來，越來越多的研究證實(shí)腸道菌群的改變與AS疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3,4]。正常生理情況下，宿主腸道內(nèi)定植著大量的腸道菌群包括細(xì)菌、病毒、原蟲、蠕蟲和真菌，這些腸道菌群作為一個(gè)“特殊器官”，在宿主生命過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。但AS疾病中腸道菌群發(fā)生顯著改變。采用16S rRNA測序分析動(dòng)脈粥樣硬化癥患者與健康志愿者腸道菌群發(fā)現(xiàn)存在顯著差異，如在屬水平上，Collinsella菌在動(dòng)脈硬化患者腸道內(nèi)顯著增多，與此同時(shí)，Roseburia、Eubacterium與健康者相比顯著減少[6,7]。另一項(xiàng)研究表明，腸道菌群中擬桿菌、梭菌屬、乳桿菌與動(dòng)脈粥樣硬化以及冠心病密切相關(guān)[8]，但是確切的相關(guān)機(jī)制尚不清楚。腸道菌群中乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）能夠緩解部分患者疾病，并且增加患者腸道菌群多樣性，降低炎癥水平與膽固醇水平[9]。

慢性炎癥已被證實(shí)參與了包括AS在內(nèi)的多種慢性病的發(fā)生發(fā)展[10]。動(dòng)脈粥樣硬化病理改變過程中，多種促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6等顯著增加[11]。ApoE存在于除了LDL以外的所有脂蛋白中，主要通過LDL受體（LDLR）途徑和非LDLR途徑參與血漿TC、TG的轉(zhuǎn)運(yùn)與清除[12]。在ApoE-/-基因敲除小鼠中證實(shí)，采用Tlr4和/或Myd88基因敲除可以減少炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)而減少主動(dòng)脈斑塊的形成[13,14]。與此相對應(yīng)地，臨床研究表明AS損害部位的炎癥也明顯加重[15,16]。

菊粉（Inulin，INU）作為一種植物來源的膳食纖維，其本身不會(huì)被機(jī)體所吸收，但作為重要的益生元已在多種慢性代謝性疾病中被證實(shí)具有改善作用，如酒精性肝病[17]、非酒精性脂肪性肝病[18]、多囊卵巢綜合征[19]、Ⅱ型糖尿病[20]、結(jié)腸炎[21]和結(jié)腸癌[22]。但是INU干預(yù)對于AS的研究報(bào)道不多且不一致，本研究旨在確定菊粉干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠的作用及對于炎癥和腸道菌群的影響，為心血管疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備

AU400全自動(dòng)生化分析儀，奧林巴斯；Multiskan GO全自動(dòng)酶標(biāo)儀、TRACE 1310-ISQ LT氣-質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛；DMI3000倒置顯微鏡及數(shù)碼攝像系統(tǒng)，萊卡；AccuriTMC6流式細(xì)胞儀，BD。

1.1.2 試劑

鱟試劑檢測試劑盒，廈門鱟試劑；油紅O染色、馬松染色和HE染色試劑，北京索萊寶；流式多重蛋白定量（Cytometric bead array，CBA）小鼠炎癥因子檢測試劑盒，BD；短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs）標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-aldrich；PCR引物，上海生工；PCR反應(yīng)采用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix試劑盒，New England Biolabs。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、飼料及菊粉

45只8周齡雄性ApoE-/-小鼠（20～22 g），購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，其許可證號為scxk2016-0006，在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）環(huán)境下飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究均通過了寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)倫理審核（2016-106）。菊粉購自中國豐寧平安高科實(shí)業(yè)有限公司，純度為91%。高脂飲食（High fat diet，HFD）飼料（60%脂肪，20%碳水化合物，20%蛋白質(zhì)，含1.2%膽固醇，飼料編號TP28520）購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)報(bào)道方法采用高脂ApoE-/-小鼠建立AS模型[23]。將小鼠隨機(jī)分為對照組（CON）、AS模型組（AS）和INU干預(yù)AS組（AS+INU）。其中，CON組小鼠給予正常飲食，AS組給予HFD飲食，AS+INU組在AS的基礎(chǔ)上飲水中加INU（10 g/kg體重)。每周監(jiān)測體重（body weight，BW），每日記錄食物攝入量。干預(yù)12周后，分別采集新鮮小鼠糞便（5個(gè)（只）/組）用于后續(xù)腸道菌群測序及SCFA分析。隨后處死小鼠，收集血漿和主動(dòng)脈根部組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 檢測指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 主動(dòng)脈根部病理學(xué)觀察

主動(dòng)脈根部組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片后，分別采用油紅O染色、馬松染色、蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察各組病理改變并采用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.3.2 血脂指標(biāo)的檢測

全自動(dòng)生化檢測儀分析血漿中TC、TG、LDL和高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL）的變化。

1.3.3 16S rRNA腸道菌群測序與分析

各組分別無菌收集新鮮的小鼠糞便標(biāo)本各5個(gè)，立即保存在-80 ℃冰箱。待各組收齊后，采用以往報(bào)道過的十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）方法[24]提取糞便樣本中DNA。經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定后，采用細(xì)菌V3-V4區(qū)引物（341F 5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' 和 806R 5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建庫后送北京諾禾致源公司采用Illumina HiSeq 2500測序平臺測序及分析。

1.3.4 鱟試劑法檢測血漿脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）水平

采用鱟試劑盒說明書檢測各組血漿LPS水平。

1.3.5 微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)（CBA）檢測炎癥因子

按照小鼠炎癥因子CBA檢測試劑盒的說明書要求，首先準(zhǔn)備好標(biāo)準(zhǔn)品、混合微球及待測樣本（血漿和主動(dòng)脈根部組織研磨上清液）。其次，每個(gè)流式管中分別加入混合微球50 μL。隨后標(biāo)準(zhǔn)品流式管和待檢測樣品管中分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品50 μL，渦旋混勻。接著流式管中分別加入PE標(biāo)記的檢測試劑50 μL，混勻后室溫避光孵育2 h。每管分別加入細(xì)胞染色緩沖液1 mL并混勻，300 ×g離心5 min，棄上清后重復(fù)洗滌1次。最后，所有流式管分別加入細(xì)胞染色緩沖液300 μL重懸微球，立即上機(jī)檢測樣本并采用FACP軟件分析炎癥因子含量。

1.3.6 氣質(zhì)聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）檢測SCFAs

采用美國Thermo公司的TRACE 1310-ISQ LT氣-質(zhì)聯(lián)用儀。色譜柱為Agilent HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，分流比為10:1。進(jìn)樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃。程序升溫起始溫度90 ℃，然后以10 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至150 ℃，最后以25 ℃/min升溫至250 ℃維持2 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min。質(zhì)譜（MS）條件：電子轟擊電離（EI）源，SIM掃描方式，電子能量70 eV。標(biāo)準(zhǔn)品曲線的制作：稱取適量的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醚配分別配制成0.01、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100、250、500 μg/mL十一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度。對標(biāo)準(zhǔn)液的濃度系列分別進(jìn)行GC-MS檢測，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（X）為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)進(jìn)行精密度、重復(fù)性、回收率、定量限的考察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示。三組之間比較采用方差分析。結(jié)果符合正態(tài)分布，則兩兩比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 菊粉干預(yù)顯著改善動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血管病變

從圖1a、b中的大體油紅O和顯微鏡下油紅O染色結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，與CON對照組大體油紅O及顯微鏡下油紅O染色百分比3.66%、1.19%相比，AS模型組分別為50.39%、8.76%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001），表明AS疾病發(fā)生發(fā)展中動(dòng)脈血管中脂質(zhì)顯著堆積。而在INU干預(yù)后分別減少至40.54%、6.51%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），證實(shí)INU的長期干預(yù)能顯著減緩AS血管斑塊的脂質(zhì)沉積，有助于改善疾病。馬松染色結(jié)果表明，AS組動(dòng)脈血管纖維化水平72.06%與CON組的2.57%相比顯著加重（p<0.001，圖1a、d）；而INU能夠改善血管纖維化水平至57.18%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01，圖1a、d）。進(jìn)一步通過常規(guī)病理HE染色表明，AS疾病組的動(dòng)脈血管病理損害較為嚴(yán)重，而其可以被INU干預(yù)后部分逆轉(zhuǎn)。

圖1 主動(dòng)脈根部組織切片染色檢測INU干預(yù)AS的效果Fig.1 Detection of the effects of INU intervention on AS by tissue section staining of aorta root

這些病理檢測結(jié)果均提示，膳食INU在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)條件下能夠顯著改善動(dòng)脈粥樣硬化的病理損害。以往研究中，Rault-Nania等[25]亦發(fā)現(xiàn)膳食纖維能夠顯著改善AS疾病的發(fā)生。但是，另一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)膳食纖維不能夠改善AS[26,27]。通過分析上述這兩個(gè)研究結(jié)果矛盾的原因，發(fā)現(xiàn)可能是由于采用的動(dòng)物模型不一致：前者采用的是ApoE-/-小鼠，但是并未給予高脂高膽固醇飲食；而后者盡管給予了高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)AS，但不是采用ApoE-/-小鼠，而是采用其實(shí)驗(yàn)室制備一種模型高膽固醇血癥的APOE*3-Leiden.CETP小鼠。基于此，試圖采用更為廣泛的HFD飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠制備AS模型，進(jìn)一步確定INU對于AS的作用，而結(jié)果表明INU能夠有效改善AS疾病的發(fā)生發(fā)展，這為膳食纖維防治臨床AS提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此結(jié)果與以往的INU能夠改善多種慢性代謝性疾病如Ⅱ型糖尿病[20]、非酒精性脂肪肝病[18]、酒精性肝病[17,28]、多囊卵巢綜合征[18]等的結(jié)果相一致，證實(shí)了INU的可靠性。由于INU屬于植物來源的低聚果糖，作為一種益生元能夠有效改善腸道菌群但不會(huì)被機(jī)體所吸收，為AS的防治提供了安全、廉價(jià)而有效的選擇。

2.2 菊粉膳食干預(yù)逆轉(zhuǎn)部分AS常規(guī)指標(biāo)

進(jìn)一步檢測了不同組之間的基礎(chǔ)指標(biāo)的變化（圖2）。其中，各組體重在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開始時(shí)無差異（圖2a），而在干預(yù)結(jié)束時(shí)，與對照組BW 26.43 g相比，AS組的BW增加至32.99 g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），這可能是由于對照組只給予了正常飲食，而AS組小鼠給予了高脂高膽固醇飲食。但I(xiàn)NU干預(yù)3個(gè)月后BW為32.02 g，與AS相比無顯著差異（p>0.05），說明膳食纖維并不是通過改變體重而改善AS疾病。同樣，發(fā)現(xiàn)CON組、AS組和AS+INU組的平均食物攝入量分別為34.60 g、34.06 g、35.48 g，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05，圖2b），提示INU對AS的改善作用與飲食攝入量無關(guān)。以往的研究表明，INU能夠增加不同階段糖尿病的體重并分析可能與改善腸道能量吸收有關(guān)[20]，但是在非酒精性脂肪性肝病的研究中發(fā)現(xiàn)體重在INU干預(yù)后是顯著下降的[18]。本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)顯著改變的體重，這可能是由于INU對于不同慢性病體重的影響是不一樣的。有研究表明INU不會(huì)對飲食攝入量造成顯著影響，這與本研究的結(jié)果是一致的[18,20]。

圖2 INU長期干預(yù)對于AS相關(guān)指標(biāo)的影響Fig.2 Impacts of INU long-term intervention on parameters of AS

進(jìn)一步分析動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的脂質(zhì)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)（圖2c～f），與CON對照組血漿TC 6.81 mmol/L、TG 0.21 mmol/L、LDL 1.52 mmol/mL、HDL 6.22 mmol/mL相比，AS疾病組的血漿TC、TG、LDL分別升高至17.01 mmol/L、0.51 mmol/L、2.65 mmol/mL，而HDL下降至3.36 mmol/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。而INU干預(yù)3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低AS疾病血漿TC、TG及LDL至14.04 mmol/L、0.35 mmol/L、2.31 mmol/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），但HDL 3.48 mmol/mL無影響，提示膳食纖維的長期攝入不僅能夠改善AS的病理損害，還能顯著逆轉(zhuǎn)AS的脂質(zhì)異常。以往研究亦表明INU及其多種聚合物都能顯著改善AS的脂質(zhì)代謝[29]。研究證實(shí)膳食纖維可以改善其他多種慢性代謝性疾病的脂質(zhì)代謝紊亂[17-20]，其可能機(jī)制在于改善腸道菌群及其代謝產(chǎn)物，進(jìn)而由后者發(fā)揮血脂調(diào)控作用[30]。

2.3 菊粉膳食干預(yù)顯著改變腸道菌群組成

INU作為一種重要的益生元，被廣泛報(bào)具有顯著調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)作用，為此進(jìn)一步檢測了菊粉干預(yù)對AS疾病腸道菌群的影響。本研究各組小鼠糞便（5只/組）采用16S rRNA腸道菌群測序，其原始測序數(shù)據(jù)已上傳到NCBI公共序列讀取數(shù)據(jù)庫，登記號為PRJNA624814。如圖3a和3b所示，能夠發(fā)現(xiàn)在ɑ多樣性上CON組與AS疾病組有差異，表明疾病組小鼠腸道菌群多樣性發(fā)生了改變。而ɑ多樣性上在AS組和AS+INU組之間沒有差異，提示INU并沒有對AS疾病的菌群種類的豐度產(chǎn)生顯著影響。通過主坐標(biāo)分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）（圖3c）與非度量多維尺度分析（Non-metric multi- dimensional scaling，NMDS）（圖3d）的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組樣本位點(diǎn)顯著分開，提示三組的β多樣性具有顯著差別，表明AS疾病腸道菌群總體組成上發(fā)生了顯著改變，而其可以通過INU長期干預(yù)而顯著調(diào)節(jié)。韋恩圖也提示三組共有240種細(xì)菌，而CON對照組具有更多的特有的菌的種類（129種），與此同時(shí)AS疾病組僅具有特有的14種，而在膳食纖維干預(yù)后其特有的增加到67種（圖3g）。

進(jìn)一步分析各組之間的差異菌，發(fā)現(xiàn)在門水平上與CON組菌厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroides）和變形桿菌門（Proteobacteria）相對豐度0.26、0.69、2.55×10-3相比（圖3e、3h），AS疾病的主要組成菌厚壁菌門和變形桿菌門的相對豐度均顯著增加至0.78、0.03，而擬桿菌門卻減少至7.93×10-2，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001，p<0.001，p=0.001）；與此相對應(yīng)的是，厚壁菌門/擬桿菌門（Firmicutes/Bacteroides，F(xiàn)/B）的比值從CON的0.38顯著增加至AS的9.84（p<0.001，圖3i）。而INU干預(yù)后擬桿菌門為8.28×10-2，與AS相比具有升高趨勢，而厚壁菌門為0.64，與AS相比呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，這兩種菌在兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）；但有趣的是，INU干預(yù)組的F/B比值顯著下降至7.73，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。

圖3 INU對于AS腸道菌群的影響Fig.3 Modulation of INU on gut microbiota in AS

在屬水平上，較之CON組的Alistipes、Muribaculum、Candidatus_Saccharimonas、Blautia、Intestinimonas、Parabacteroides、Bilophila、Anaerotruncus、Parasutterella、Oscillibacter、Negativibacillus的相對豐度4.91×10-2、8.84×10-3、6.13×10-3、1.60×10-4、2.07×10-3、1.94×10-3、5.21×10-5、3.53×10-4、7.06×10-4、3.23×10-4、1.12×10-5相比，AS組的Alistipes、Muribaculum、Candidatus_Saccharimonas顯著減少至5.80×10-3、3.72×10-6、1.12×10-5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；而Blautia、Intestinimonas、Parabacteroides、Bilophila、Anaerotruncus、Parasutterella、Oscillibacter、Negativibacillus顯著增加至2.07×10-3、1.70×10-2、1.94×10-3、9.65×10-3、5.22×10-3、2.25×10-3、3.85×10-3、1.96×10-3（p<0.05），表明AS疾病模型腸道菌群在屬水平上發(fā)生了顯著改變。INU長期干預(yù)近3個(gè)月后，可以發(fā)現(xiàn)AS屬水平上菌群組成發(fā)生部分逆轉(zhuǎn)，主要體現(xiàn)在Faecalibaculum的相對豐度增加至0.28，而AS異常增加的Alistipes、Intestinimonas、Bilophila、Oscillibacter、Negativibacillus均減少至1.09×10-3、3.46×10-4、1.86×10-4、1.56×10-4、3.72×10-6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。

上述腸道菌群在門與屬水平上顯著差異菌表明AS疾病會(huì)引起腸道菌群的顯著改變，如門水平上的主要組成菌厚壁菌門、擬桿菌、變形桿菌均發(fā)生了顯著的變化，而在屬水平上也有多種菌顯著發(fā)生了變化；而通過3個(gè)月長期給予膳食纖維干預(yù)能夠顯著調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，糾正AS中異常改變的菌的豐度。其中，在門水平上，顯著改善F/B比值，說明可能是通過在降低厚壁菌門或升高擬桿菌門發(fā)揮作用。有文獻(xiàn)報(bào)道采用擬桿菌Bacteroides vulgatus和Bacteroides dorei直接干預(yù)可以顯著抑制AS疾病進(jìn)展[31]。該研究結(jié)果與本研究中改善擬桿菌及F/B比值的結(jié)果是一致的。而在屬水平上，特別是Faecalibaculum并沒有在AS中發(fā)生顯著變化，但是在膳食纖維干預(yù)后卻成為屬水平上顯著改變的關(guān)鍵菌。最近有研究揭示該菌是重要的產(chǎn)SCFAs菌[32]，而后者作為腸道菌群重要代謝產(chǎn)物參與了多種生理功能，為此后續(xù)又進(jìn)一步檢測了SCFAs的含量（結(jié)果2.6）。

2.4 菊粉膳食干預(yù)減輕內(nèi)毒素血癥

當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，腸道革蘭陰性菌來源的LPS引起的內(nèi)毒素血癥被認(rèn)為是引發(fā)多種慢性代謝性疾病炎癥重要觸發(fā)因素[11]，為此檢測了外周血LPS水平。結(jié)果表明，AS疾病組的血漿LPS水平0.44 EU/mL較之CON組0.20 EU/mL顯著升高（p<0.001，圖4），提示AS疾病中存在內(nèi)毒素血癥，這與以往的AS臨床與動(dòng)物研究結(jié)果是一致的[33,34]。

而在膳食纖維長期干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)AS疾病血漿中LPS水平顯著降低至0.34 EU/mL（p<0.01，圖4），表明INU能夠顯著緩解AS疾病中的內(nèi)毒素血癥。以往INU研究表明能顯著下調(diào)多種慢性病中血漿LPS水平[17-20,35]，與本研究結(jié)果是一致的，說明INU可能是通過抑制LPS在腸道中的產(chǎn)生，減少其經(jīng)門靜脈入肝及血液循環(huán)，進(jìn)而抑制AS慢性低度炎癥的發(fā)生。

圖4 INU干預(yù)對AS血漿LPS的影響Fig.4 The impact of INU intervention on LPS in AS

2.5 菊粉膳食干預(yù)降低血漿與血管組織炎癥因子濃度

圖5 膳食INU干預(yù)對于AS炎癥因子的影響Fig.5 The impacts of dietary INU on the inflammatory cytokines in AS

通過分析上述發(fā)現(xiàn)的血漿異常升高的LPS提示AS可能存在炎癥，以往研究中也表明炎癥與AS密切相關(guān)[10-15]，故本研究又進(jìn)一步分析了膳食纖維干預(yù)對于AS炎癥的影響。結(jié)果提示，與CON對照組主動(dòng)脈組織和血漿中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-10的濃度19.89 pg/mL和6.64 pg/mL、13.38 pg/mL和3.60 pg/mL、34.86 pg/mL和6.08 pg/mL、13.79 pg/mL和2.98 pg/mL、52.19 pg/mL和2.99 pg/mL相比，AS疾病組主動(dòng)脈組織和血漿中的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A升高至39.89 pg/mL和10.02 pg/mL、21.83 pg/mL和6.42 pg/mL、150.20 pg/mL和12.80 pg/mL、25.70 pg/mL和9.84 pg/mL，主動(dòng)脈根部組織IL-10降低至47.24 pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；而AS血漿中抑炎因子IL-10為3.16±0.13 pg/mL，無顯著改變（p>0.05）。這些結(jié)果提示AS疾病發(fā)生發(fā)展中存在慢性低度炎癥，這與以往研究中AS中顯著升高的促炎因子結(jié)果是一致的[36]。

經(jīng)膳食纖維長期干預(yù)12周后，可以發(fā)現(xiàn)AS疾病中的主動(dòng)脈組織和血漿中的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A降低至27.32 pg/mL和6.59 pg/mL、19.15 pg/mL和4.60 pg/mL、49.81 pg/mL和8.57 pg/mL、16.70 pg/mL和3.57 pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；而抑炎因子IL-10的濃度49.35 pg/mL和2.80 pg/mL，無顯著改變（p>0.05）。這些結(jié)果表明膳食INU顯著抑制了AS慢性低度炎癥，而原因可能是膳食纖維通過改善腸道菌群失調(diào)，減少LPS的異位入血，進(jìn)而減少了其引發(fā)的炎癥損害。這里顯著升高的IL-17A提示分泌IL-17A的Th17細(xì)胞可能參與了INU的有效性。此外，可能還有其他多種免疫細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Tregs）、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等參與該INU對于炎癥的調(diào)控過程。如有研究表明巨噬細(xì)胞及其極化參與了INU對于慢性病炎癥抑制作用[28]。前期發(fā)現(xiàn)INU能夠顯著影響其他慢性病中的髓源抑制性細(xì)胞（Myeloid suppressor cells，MDSCs）[37]和腸道粘膜免疫γδT細(xì)胞[38]。但是這些免疫炎癥細(xì)胞是否參與了INU對AS的作用及其相關(guān)分子機(jī)制需后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

此外，在膳食纖維改善腸道菌群失調(diào)過程中，能夠改變多種細(xì)菌組成及其代謝產(chǎn)物如SCFAs、色氨酸代謝、膽汁酸代謝、氧化三甲胺（Trimethylamine oxide，TMAO）等，而這些腸道菌群來源的代謝產(chǎn)物已被證實(shí)參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，亦有可能參與調(diào)控INU抑制炎癥的機(jī)制，如SCFAs已經(jīng)被證實(shí)能夠通過結(jié)合G-蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPR）而顯著抑制炎癥的發(fā)生[39]。

2.6 菊粉能夠顯著改變AS疾病中腸道菌群來源的SCFAs含量

圖6 INU對于AS腸道菌群來源SCFAs的作用Fig.6 The effect of INU on gut microbilota-derived SCFAs in AS

上述研究發(fā)現(xiàn)INU能夠調(diào)節(jié)腸道菌群并抑制LPS及炎癥的發(fā)生，然而由于腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFAs被報(bào)道也能顯著抑制炎癥的發(fā)生[40]，故本研究又進(jìn)一步檢測膳食纖維干預(yù)后SCFAs的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組乙酸、丙酸和戊酸的值1218.00 μg/g、115.30 μg/g、15.25 μg/g相比，AS疾病組乙酸、丙酸和戊酸降低至505.00 μg/g、64.52 μg/g、5.74 μg/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；在INU長期干預(yù)后能夠顯著改善至631.90 μg/g、92.70 μg/g、11.25 μg/g（p<0.05），而其他短鏈脂肪酸無顯著改變，提示AS疾病存在的腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致異常減少的代謝產(chǎn)物SCFAs能夠通過膳食纖維的干預(yù)而部分逆轉(zhuǎn)。已有研究表明，SCFAs的減少會(huì)對機(jī)體造成如下的影響[41-43]：首先，SCFAs是能量代謝的基本原料，而其減少將可能引起腸道內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝紊亂，后者將會(huì)破壞腸道屏障功能；其次，SCFAs能夠通過結(jié)合細(xì)胞受體GPR抑制核因子（Nuclear factor，NF）-κB炎癥信號通路，進(jìn)而顯著抑制炎癥因子的產(chǎn)生，而SCFAs的減少將會(huì)導(dǎo)致炎癥的加重；再者，SCFAs作為去乙?；福℉istone deacetylase，HDAC）的抑制劑，能夠通過影響基因的乙酰化水平進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)，影響疾病的發(fā)生發(fā)展，而SCFAs的減少可能是參與疾病發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)的重要原因。而本研究中INU干預(yù)AS過程中顯著改變的SCFAs是通過怎樣的途徑發(fā)揮作用仍需后續(xù)進(jìn)一步研究揭示。

3 結(jié)論

以動(dòng)脈粥樣硬化癥為基礎(chǔ)的心腦血管疾病是當(dāng)前重大疾病，發(fā)病人群廣泛，由其導(dǎo)致的死亡率位居首位，故尋找安全、有效、低廉的防治方法與策略意義重大。本研究證實(shí)菊粉能夠有效改善AS疾病的發(fā)生發(fā)展，并初步提示其作用與調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制炎癥發(fā)生密切相關(guān)。本研究為膳食纖維干預(yù)臨床AS疾病提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與防治思路。