劉淼，高悅，李康帆，何維維，李靖原，王婷，錢衛(wèi)東

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）

木犀草素（3’,4’,5,7-四羥基黃酮）是一種類黃酮多酚類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜和中草藥中?，F(xiàn)有研究表明木犀草素具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[4]和抗菌[5]等活性。值得注意的是，木犀草素作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，也是一種潛在的可用于治療腫瘤的天然活性成分。然而，木犀草素屬于脂溶性藥物，存在水溶性差和生物利用度低等問(wèn)題，這對(duì)其臨床應(yīng)用產(chǎn)生了一定的限制。因此，改善木犀草素成藥性缺陷是提高其臨床應(yīng)用的重要前提之一。

脂質(zhì)體是一種特殊的囊泡，由一個(gè)或多個(gè)封閉的殼或片層組成，由磷脂雙層組成，磷脂是兩親性的，其基本特征是在同一分子上有一個(gè)親脂的尾部和親水性的頭部[6]。脂質(zhì)體大小從幾十納米到幾百微米，這主要取決于所用的制備方法。脂質(zhì)體制備方法有薄膜分散法[7]、硫酸銨梯度法[8]、冷凍干燥法[9]等，其中薄膜分散法制備的脂溶性藥物脂質(zhì)體的包封率高，硫酸銨梯度法對(duì)兩親性藥物脂質(zhì)體的包封率高、滲漏小，而冷凍干燥法主要用于包裹蛋白質(zhì)、多肽等在水溶液中不穩(wěn)定的物質(zhì)。脂質(zhì)體以其血液循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，生物相容性好，生物利用度好和腫瘤特異性高等優(yōu)點(diǎn)，備受人們關(guān)注。

聚乙二醇是一種高親水性聚合物，能在脂質(zhì)體表面形成一層水化膜，可阻礙血漿成分與脂質(zhì)體表面的吸附，從而降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)脂質(zhì)體的攝取，使脂質(zhì)體在體循環(huán)中作用時(shí)間延長(zhǎng)，有利于延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。鑒于聚乙二醇及其衍生物可提高藥物載體的穩(wěn)定性[10]，研究人員通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體的表面修飾，將聚乙二醇運(yùn)用于基于脂質(zhì)體的藥物傳遞系統(tǒng)的制備研究中[11]，但對(duì)聚乙二醇木犀草素脂質(zhì)體修飾的報(bào)道較少。為此，本文利用薄膜分散法制備聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體，同時(shí)應(yīng)用Box-Behnken結(jié)合響應(yīng)面方法優(yōu)化脂質(zhì)體處方，以包封率、粒徑大小、電位等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體的最佳制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

木犀草素（CAS：491-70-3，HPLC純度≥98%）、氯仿、甲醇、蛋黃卵磷脂、膽固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、果膠酶、氯化鈉、磷酸二氫鈉和氫氧化鈉。

1.1.2 主要設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、電子分析天平、超聲波細(xì)胞破碎儀、納米粒度及ZETA電位分析儀、透射電子顯微鏡、pH計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 木犀草素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用全波長(zhǎng)掃描儀分析0.1 mg/mL木犀草素乙醇溶液和空白聚乙二醇修飾脂質(zhì)體的吸光度，明確木犀草素的最大吸收波長(zhǎng)。分別配制0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL的木犀草素乙醇溶液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，繪制線性回歸方程，所制得的回歸方程及相關(guān)系數(shù)為y=9.378x+0.0027，R2=0.995。

1.2.2 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備木犀草素脂質(zhì)體[12]，按一定比例稱取蛋黃卵磷脂、膽固醇和木犀草素，溶解于氯仿:甲醇=2:1（V/V）中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)，待薄膜形成后加入15 mL純凈水充分搖勻，置于水浴鍋中繼續(xù)水化1 h后進(jìn)行超聲處理，獲得木犀草素脂質(zhì)體溶液。接著加入等體積不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)DSPEPEG2000的水溶液，再渦旋使之均勻混合后4 ℃靜置1 h，即得聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體[13]。

1.2.3 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

采用超濾離心法[14]分析聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體包封率，取3 mL脂質(zhì)體置于超濾離心管中，離心（5000 r/min）10 min，取400 μL過(guò)濾所得的溶液測(cè)定吸光值，計(jì)算游離木犀草素的含量。另取400 μL脂質(zhì)體，加入無(wú)水甲醇渦旋10 min進(jìn)行破乳，測(cè)定吸光值，計(jì)算聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體的包封率。計(jì)算公式如下：

式中：

Ma——木犀草素總濃度，mg/mL；

Mb——游離的木犀草素濃度，mg/mL。

1.2.4 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體制備的單因素實(shí)驗(yàn)

研究不同膜材（蛋黃卵磷脂:膽固醇）質(zhì)量比（4:1、6:1、8:1、10:1、12:1）、脂藥（蛋黃卵磷脂與木犀草素）質(zhì)量比（8:1、16:1、24:1、32:1）、超聲時(shí)間（10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）、水化溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）和DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%、3%、4%、5%、6%）對(duì)包封率的影響。依次選出膜材比，藥脂比，超聲時(shí)間，水化溫度和DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體包封率的影響，篩選出合適的三因素進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2.5 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體制備的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采Design-Expert試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，表1為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表，以膜材比、脂藥比、DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為三因素，將各個(gè)因素的低水平、中水平、高水平分別用-1、0、1標(biāo)記。以包封率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Response surface experimental factor level table

1.2.6 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體的粒徑分布、電位

采用納米粒度及ZETA電位儀在室溫下進(jìn)行平均粒徑和電位（ζ）測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。

1.2.7 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體的形態(tài)分析

為了觀察聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體的形態(tài)，將所制得的聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體進(jìn)行光學(xué)分析，然后再用透射電鏡分析外貌特征。取木犀草素脂質(zhì)體樣品在水中稀釋，將20 μL稀釋樣品滴加在150目銅網(wǎng)上，靜置10 min。然后用磷鎢酸負(fù)染色液（2%）的覆蓋網(wǎng)格2 min，自然干燥，用透射電鏡對(duì)樣品進(jìn)行分析[15]。

1.2.8 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體在體外模擬液中的釋放實(shí)驗(yàn)[16]

在100 mL胃液、小腸液和結(jié)腸液中分別加入25 mL聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體溶液，置于100 r/min，溫度為37 ℃的搖床中，每隔一定時(shí)間段取樣分析，取樣時(shí)段為0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h，分別取出1 mL釋放介質(zhì)，同時(shí)加入等溫等體積的對(duì)應(yīng)模擬液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定木犀草素的含量，計(jì)算累積釋放率。計(jì)算公式如下：

式中：

Ea——時(shí)間a時(shí)測(cè)定的游離木犀草素含量，mg；

Eb——反應(yīng)剛開(kāi)始時(shí)測(cè)定游離木犀草素的含量，mg；

Etotal——包封的木犀草素總量，mg。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用origin 2017軟件分析并作圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 木犀草素含量分析

從圖1可知，木犀草素的最大吸收波長(zhǎng)在370 nm處，而空白聚乙二醇修飾脂質(zhì)體在370 nm處無(wú)最大吸收，因而選擇370 nm作為木犀草素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 木犀草素的全波長(zhǎng)掃描Fig.1 The full wave scanning of luteolin

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 膜材比對(duì)聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體包封率的影響

膽固醇與磷脂是共同構(gòu)成脂質(zhì)體的基礎(chǔ)物質(zhì)，膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性的作用。結(jié)果如圖2a所示，隨著磷脂與膽固醇質(zhì)量比從4:1增加到12:1時(shí)，聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體的平均包封率從52.56%增大到81.43%，隨后減小至72.6%，這可能是由于起初膽固醇的相對(duì)含量過(guò)高，增加脂膜剛性，分子間排列緊密，木犀草素難以進(jìn)入磷脂雙分子層中，但是隨著膜材比的增加，使得膽固醇的相對(duì)含量降低，包封率增加，在10:1時(shí)達(dá)到最大。但是，隨著膽固醇的相對(duì)量繼續(xù)降低到一定程度時(shí)，蛋黃卵磷脂的相對(duì)量過(guò)多，水化過(guò)程困難，蛋黃卵磷脂聚集，導(dǎo)致包封率下降，這與之前的報(bào)道基本一致[17]。

圖2 單因素對(duì)聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體包封率的影響Fig.2 Effect of single factor on the entrapment efficiency of luteolin liposome modified by polyethylene glycol

2.2.2 脂藥比對(duì)聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體包封率的影響

結(jié)果如圖2b所示，木犀草素相對(duì)加入量太多，可能超過(guò)了脂質(zhì)體能包封的最大量，導(dǎo)致難以形成脂質(zhì)膜；而木犀草素相對(duì)加入量太少，則造成蛋黃卵磷脂利用度不高[18]。因此隨著脂藥比的4:1增加到32:1時(shí)，包封率先增大到88%隨后減小到73.56%，當(dāng)脂藥比為16:1時(shí)包封率最大。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體包封率的影響

適宜的超聲時(shí)間有利于脂質(zhì)體的形成，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使部分脂質(zhì)體破裂從而降低包封率[19]。結(jié)果如圖2c所示，脂質(zhì)體的，包封率隨著超聲時(shí)間的增大而增大，當(dāng)超聲時(shí)間為15 min時(shí)，包封率達(dá)到最大即為80.86%。

2.2.4 水化溫度對(duì)聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體包封率的影響

本文所用的磷脂為天然蛋黃卵磷脂，溫度過(guò)高會(huì)加速蛋黃卵磷脂的氧化，使得脂質(zhì)體膜出現(xiàn)降解，導(dǎo)致藥物流出，引起包封率下降[20]，所以水化溫度不能太高。結(jié)果如圖2d所示，水化溫度在40 ℃時(shí)，包封率較高，為81.66%。

2.2.5 DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體包封率的影響

研究報(bào)道若DSPE-PEG2000使用量過(guò)大，將不利于其進(jìn)入脂質(zhì)體的磷脂雙分子層中[21]。結(jié)果如圖2e所示，DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從2%增加到6%時(shí)，脂質(zhì)體平均包封率依次為75.46%、85.80%、73.30%、64.77%、51.33%，呈先升高后降低現(xiàn)象。

2.3 利用響應(yīng)曲面方法優(yōu)化聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體制備工藝

使用Design-Expert設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，三因素為膜材比、脂藥比和DSPEPEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

2.3.1 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Expert分析表3和表4，對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合，其方程包封率（Y）=88.74-0.72×A-1.17×B-3.08×C-2.5×A×B-1.75×A×C+3.25×B×C-16.89×A2-14.07×B2-9.42×C2（R2=0.98，F(xiàn)=45.17，失擬度檢驗(yàn)F=0.31，p=0.82）。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

表4 回歸方程誤差統(tǒng)計(jì)分析表Table 4 Statistical table of regression equation error

由二次方程結(jié)果可知擬合模型F值高，p<0.001，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著和較高的擬合度，失擬項(xiàng)F值為0.31，值較小且p=0.82>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，表明擬合模型結(jié)果好，符合實(shí)驗(yàn)的要求，可用于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。二次回歸方程的系數(shù)R2=0.98>0.95，變異系數(shù)CV=3.79%<10%，證明變異性差，實(shí)際值與預(yù)計(jì)值之間存在較高的相關(guān)性，能夠準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)實(shí)際情況。因此Box-Behnken設(shè)計(jì)的模型可用于聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體的制備工藝分析和預(yù)測(cè)。

2.3.2 各因素的交互作用對(duì)脂質(zhì)體壁材粒徑的影響

Design-Expert分析可知，3個(gè)因素中DSPE-PEG 2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)包封率的影響最大，其次是脂藥比和膜材比。三因素之間均存在一定的交互作用，其中DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脂藥比的交互作用最為顯著（F=6.04）。為探討三因素之間交互作用對(duì)木犀草素脂質(zhì)體包封率的影響，根據(jù)二次回歸方程的擬合結(jié)果，將膜材比，脂藥比和DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)中的一個(gè)因素固定，以獲得另外兩個(gè)因素對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。

從圖3可以看出，三個(gè)響應(yīng)曲面圖坡度都較陡峭，其中固定DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，膜材比和脂藥比交互的響應(yīng)曲面圖最陡峭，表明這三因素對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響均有明顯的影響，但膜材比和脂藥比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響最大。綜合表3結(jié)果可知，膜材比和脂藥比、膜材比和DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，兩兩之間交互作用不顯著（p>0.05），而脂藥比和DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間具有顯著的交互作用（p<0.05）。

圖3 脂質(zhì)體制備工藝交互作用曲面Fig.3 Response surface analysis of interaction between liposomes preparation parameter

2.3.3 最佳制備工藝參數(shù)的確定

利用軟件進(jìn)行優(yōu)化，聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體最佳制備參數(shù)為：在保持其它工藝條件不變的情況下，當(dāng)膜材比為10:1，脂藥比為16:1，DSPE-PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，超聲時(shí)間15 min和水化溫度40 ℃時(shí)，所制備的聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體，其平均包封率為86.30%，表明木犀草素脂質(zhì)體最佳制備工藝的可行性較好。

2.4 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體粒徑及電位

取一定量聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體溶液，用去離子水稀釋一定倍數(shù)后，利用納米粒度及ZETA電位儀測(cè)定粒徑和Zeta電位。結(jié)果如圖4a所示，脂質(zhì)體平均粒徑為134.1 nm，且大多數(shù)分布在80～200 nm。曹大振等[22]研究以大豆卵磷脂、膽固醇為膜材，用薄膜-超聲分散法制備了表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯脂質(zhì)體，制備的脂質(zhì)體的平均粒徑為132.74 nm，與本研究所制備的脂質(zhì)體粒徑相當(dāng)。脂質(zhì)體多分散指數(shù)（PDI）為0.14，PDI與脂質(zhì)體的穩(wěn)定性緊密相關(guān)，當(dāng)PDI值≥1.0，脂質(zhì)體均一性較差，而PDI值≤0.30，表明60%以上的脂質(zhì)體粒徑大小相當(dāng)[23]，均一性較好，符合要求。Zeta電位是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體分散穩(wěn)定性的重要參數(shù)，如圖4b所示，本文所制備的脂質(zhì)體電位為-14.07 mV，為帶負(fù)電的脂質(zhì)體，而Zeta電位是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體制劑分散穩(wěn)定性的重要參數(shù)，Zeta電位不僅可表征粒子的表面電荷，而且可用于分析粒子間排斥力，可以預(yù)測(cè)分散體的穩(wěn)定性，理論上電荷脂質(zhì)體帶負(fù)電荷越多其越穩(wěn)定。朱順耀等[24]采用改良逆相乙醇注入法制備唾液酸修飾的綠原酸脂質(zhì)體，其Zeta電位為-25.3 mV。此外，研究發(fā)現(xiàn)DSPE-PEG2000也可以增加脂質(zhì)體的空間位阻，使脂質(zhì)體更加穩(wěn)定[15]。

圖4 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體粒徑分布及Zeta電位圖Fig.4 Distribution of particle size and Zeta potential of luteolin liposome modified by polyethylene glycol

2.5 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體的形貌

如圖5，聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體呈均一透明，具有藍(lán)色乳光的膠體形態(tài)（圖5a），且在激光照射下能產(chǎn)生丁達(dá)爾效應(yīng)（圖5b），表明制備的脂質(zhì)體狀態(tài)較好。用磷鎢酸負(fù)染于透射電鏡下觀察木犀草素脂質(zhì)體和聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體形態(tài)（圖5b），觀察到木犀草素脂質(zhì)體（圖5c）和聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體（圖5d）外觀比較圓整，多數(shù)為球形，且大小較為均一，少數(shù)形狀不規(guī)則。

圖5 木犀草素脂質(zhì)體形貌特征Fig.5 Morphology of luteolin liposome

2.6 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體在體外不同模擬液的釋放曲線

以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，以木犀草素累積釋放率為縱坐標(biāo)，結(jié)果如圖6所示，聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體在胃、小腸和結(jié)腸模擬液中累積釋放量分別為39.08%、43.67%和71.71%。

圖6 聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體在不同模擬液中的釋放曲線Fig.6 Release kinetics of luteolin liposome modified by polyethylene glycol in different simulated medium

3 結(jié)論

木犀草素具有多種藥理作用，但水溶性差，因此將其制備成脂質(zhì)體不僅可提高溶解度，而且可增加生物利用度。本文以木犀草素包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明水化溫度和超聲時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響較小，進(jìn)而應(yīng)用響應(yīng)面方法優(yōu)化蛋黃卵磷脂和DSPE-PEG2000含量，獲得制備工藝參數(shù)，構(gòu)建聚乙二醇修飾木犀草素的脂質(zhì)體。經(jīng)優(yōu)化后所制備的聚乙二醇修飾木犀草素脂質(zhì)體平均粒徑為134.1 nm，Zeta電位為-14.07 mV，平均包封率為86.30%，且體外緩釋性良好。