胡金曹，沈瀚，陶月，李雷，張永臣，寧明哲

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210008； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院/

2019年12月以來(lái)，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndro me coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)在全球范圍內(nèi)迅速蔓延。2020 年 3 月 3 日，國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第八版修訂版)[1]，增加了抗體血清學(xué)檢測(cè)作為輔助診斷病毒感染的依據(jù)之一。全面了解SARS-CoV-2病毒載量及其針對(duì)不同抗原的特異性抗體在COVID-19患者疾病進(jìn)展中的動(dòng)態(tài)變化，探討病毒載量和抗體水平的相關(guān)性，有助于了解抗體在病毒清除和疾病進(jìn)展中的作用。

本研究回顧性分析19例COVID-19患者從發(fā)病當(dāng)天到發(fā)病第50天期間咽拭子SARS-CoV-2的病毒載量及血清針對(duì)SARS-CoV-2不同抗原的IgM、IgG抗體水平。

1 材料與方法

1.1 材料

選取南京市第二醫(yī)院湯山分院收治的19例COVID-19患者，收集患者不同時(shí)間點(diǎn)采集的208份咽拭子及72份血清標(biāo)本，采集時(shí)間為發(fā)病后第0～50天。同時(shí)收集2019年10月份的健康體檢志愿者的血清標(biāo)本45份。

1.2 儀器與試劑

瑞士Roche公司生產(chǎn)的Cobas LC 480全自動(dòng)熒光定量PCR分析儀，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的iMark酶標(biāo)儀。所用試劑為碩世生物科技有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法,批號(hào):20200108)。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料 回顧性分析COVID-19患者的人口學(xué)特征(性別和年齡)、流行病學(xué)史、主要臨床癥狀和體征、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等。本研究已經(jīng)通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2020-023-01)。

1.3.2 SARS-CoV-2核酸檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行核酸檢測(cè)。擴(kuò)增基因?yàn)?ORF-1ab 基因和 N 基因，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增通道為 FAM 和 VIC，CY5 通道為內(nèi)標(biāo)。反應(yīng)參數(shù)：(1) 50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，1個(gè)循環(huán)；(2) 95 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；(3) 95 ℃變性10 s，55 ℃退火、延伸檢測(cè)40 s，45個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)。結(jié)果判讀：陽(yáng)性樣本參考值為FAM、VIC兩個(gè)通道同時(shí)滿(mǎn)足待測(cè)樣本結(jié)果Ct值≤35，曲線(xiàn)呈S型；陰性樣本參考值為兩個(gè)通道結(jié)果Ct值>38或未檢出；可疑樣本有一個(gè)通道結(jié)果Ct值≤35，其他一個(gè)通道35

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)特異性抗體IgM/IgG 首先，每孔中加100 μl 質(zhì)量濃度為1 μg·ml-1的體外重組表達(dá)并純化的SARS-CoV-2病毒核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP蛋白)、S蛋白受體結(jié)合域蛋白(receptor binding domain，RBD蛋白)、刺突糖蛋白S1亞基(spike glycoprotein S1 subunit，S1蛋白)、刺突蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ectodomain of spike glycoprotein，ECD蛋白)，4 ℃包被過(guò)夜。第2天棄液，加入200 μl·孔-1磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)，浸泡1 min，重復(fù)3次。用5%脫脂奶粉(PBST稀釋)200 μl·孔-1封閉，37 ℃孵育1 h。隨后再次洗板。將患者血清及陰性對(duì)照血清(2019年健康體檢者血清)用PBST緩沖液1∶200稀釋后，每孔加樣100 μl，37 ℃孵育1 h。再次洗板。加入1∶10 000稀釋的羊抗人IgM-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或IgG-HRP，37 ℃孵育1 h。再次洗板。每孔加入100 μl 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液，室溫避光顯色5 min。最后，每孔加入100 μl終止液(1 mol·L-1H2SO4)，5 min內(nèi)比色。用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。以2019年疫情暴發(fā)前收集的45份健康人的血清作為陰性對(duì)照，以檢測(cè)的OD450 nm均值加2SD作為cuf-off數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)或百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)來(lái)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU法進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 COVID- 19患者的臨床資料

入組COVID-19患者19例(男8例，女11例)，平均年齡47歲。依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第八版修訂版)[2]，將COVID-19患者分為COVID-19重癥組(7例中男3例，女4例，年齡31～56歲)和COVID-19輕癥組(12例中男7例，女5例, 年齡42～63歲)。重癥COVID-19患者年齡較輕癥COVID-19患者顯著大(P=0.006)?？人浴l(fā)熱及肌痛是出現(xiàn)最多的臨床癥狀。14例患者的胸部CT圖像出現(xiàn)斑片影或磨玻璃影，4例患者呈間質(zhì)改變或?qū)嵶?。?jiàn)表1。

表1 重癥與非重癥COVID-19患者的流行病學(xué)特征

2.2 ELISA法檢測(cè)IgM/IgG抗體

利用4種新冠病毒蛋白(S1、ECD、RBD和NP)作為抗原，采取ELISA法檢測(cè)COVID-19患者及健康志愿者血清中針對(duì)這些蛋白的IgM和IgG水平(圖1)。結(jié)果顯示，健康體檢志愿者的血清中針對(duì)4種新冠病毒蛋白的IgM和IgG的OD值均顯著低于COVID-19患者。以陰性對(duì)照組的檢測(cè)平均數(shù)±2SD作為陽(yáng)性cut-off值)，利用4種蛋白作為包被抗原，結(jié)果顯示72.2%～93.1%的COVID-19血清標(biāo)本呈陽(yáng)性(表2)。其中在IgM抗體中，ECD IgM陽(yáng)性檢出率最高(93.1%)；而在IgG抗體中，RBD IgG陽(yáng)性檢較高，檢出率為83.3%。

圖1 利用ELISA法檢測(cè)血清中針對(duì)4種不同新型冠狀病毒抗原的IgM和IgG水平

表2 72份標(biāo)本針對(duì)不同抗原檢測(cè)的IgM/IgG抗體定性結(jié)果

2.3 動(dòng)態(tài)檢測(cè)重癥和輕癥COVID- 19患者咽拭子病毒載量以及針對(duì)4種抗原的IgM、IgG抗體水平的變化情況

重癥患者咽拭子標(biāo)本中的病毒載量普遍較高，大部分患者對(duì)應(yīng)的抗體隨病程發(fā)展有顯著的上升(圖2、3)。所有患者病毒載量與抗體之間大致分為4種情況：(1) 重癥患者(a、b、c、f)和輕癥患者(n、o、q、s)體內(nèi)高病毒載量與高抗體水平同時(shí)存在，發(fā)病3周后，病毒載量大幅度降低，甚至消失。這提示盡管患者體內(nèi)產(chǎn)生了高水平針對(duì)新型冠狀病毒的抗體，但是卻無(wú)法有效地降低病毒載量。(2) 重癥患者(d、e)和輕癥患者(s)體內(nèi)病毒載量在抗體出現(xiàn)的初期就已經(jīng)大幅降低或消失；(3) 重癥患者(f)和輕癥患者(k、l、r)體內(nèi)的病毒載量一直較高，抗體的出現(xiàn)也較為遲緩，發(fā)病第3周后體內(nèi)才清除病毒；(4)重癥患者(g)和輕癥患者(m)體內(nèi)抗體水平上升較為緩慢，而體內(nèi)的病毒載量在發(fā)病1周內(nèi)就已經(jīng)下降或消失。總體而言，重癥患者和輕癥患者的病毒載量及抗體出現(xiàn)的模式并沒(méi)有顯著區(qū)別。

圖2 動(dòng)態(tài)檢測(cè)7例重癥COVID-19患者(a～g)自發(fā)病當(dāng)天到第50天咽拭子標(biāo)本中新型冠狀病毒的病毒載量以及針對(duì)4種新型冠狀病毒抗原的抗體(IgM和IgG)水平的變化情況

2.4 重癥及輕癥COVID- 19患者病毒載量與血清抗體水平的動(dòng)態(tài)比較

在整個(gè)病程中，重癥患者病毒載量比輕癥患者的病毒載量高，特別是在第1周和第3周(P值分別為0.035、0.032)。在抗體方面，重癥患者和輕癥患者血清中刺突蛋白相關(guān)的抗原(RBD蛋白、S1蛋白、ECD蛋白)特異性抗體水平相當(dāng)；另一方面，整個(gè)病程中，重癥患者的NP蛋白特異性抗體水平也較輕癥患者高，特別是在第4周(P=0.001 7)和第6周(P=0.03)。見(jiàn)圖4。

圖4 重癥和輕癥新冠肺炎患者病毒載量與血清抗體水平的動(dòng)態(tài)比較

3 討 論

SARS-CoV-2是一種新型β屬冠狀病毒，為一組高度多樣的、包膜的、線(xiàn)性的單股正鏈RNA，屬于已知可感染人類(lèi)的第7類(lèi)冠狀病毒[3-4]。冠狀病毒結(jié)構(gòu)形態(tài)上類(lèi)似皇冠而得名，膜表面有4種糖蛋白，即刺突糖蛋白(spike glycoprotein，S蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)、膜糖蛋白(membrane protein，M蛋白)和NP蛋白[5]。RBD蛋白和NP蛋白是SARS-CoV-2抗體檢測(cè)的主要抗原位點(diǎn)[6]。目前商業(yè)化的試劑盒多采用單一的抗原(NP蛋白或RBD蛋白)，針對(duì)多種SARS-CoV-2抗原的特異性抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)聯(lián)合病毒載量的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。

圖3 輕癥COVID-19患者從當(dāng)天到第50天咽拭子標(biāo)本中新型冠狀病毒載量與針對(duì)4種新型冠狀病毒抗原的抗體水平(IgM和IgG)的變化情況

本研究所選取的主要抗原位點(diǎn)也是S蛋白相關(guān)的3種抗原(S1、RBD和ECD)和NP蛋白。S蛋白是一種糖蛋白，由1 160～1 400個(gè)氨基酸殘基組成，并含有多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，是介導(dǎo)冠狀病毒識(shí)別、侵染宿主細(xì)胞的重要元件[7]。S蛋白通常在病毒組裝過(guò)程中被剪切為球狀的S1亞基和棒狀的S2亞基。S1亞基暴露于包膜表面，是識(shí)別、結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體的重要部位；S2 亞基嵌于包膜內(nèi)，是介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合、實(shí)現(xiàn)病毒入侵的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[7]。其中S1亞基頭部尖端含有RBD，可以與人類(lèi)受體—血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)結(jié)合[8]。對(duì)72份COVID-19患者的血清標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，S1蛋白的抗體相比于針對(duì)RBD蛋白的抗體，具有較高的檢出率；由于ECD抗原包括S1亞基和S2亞基，針對(duì)ECD抗原的抗體的檢出率略高于RBD蛋白和S1蛋白。因此，考慮利用ECD抗原作為抗體檢測(cè)試劑盒的包被抗原，可能提高早期COVID-19患者抗體檢出的敏感度。

作為病毒顆粒的核心成分，NP蛋白在冠狀病毒中含量豐富，不僅參與了病毒基因組的形成，也與冠狀病毒復(fù)制周期以及宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染的反應(yīng)有關(guān)[9]。NP蛋白位于病毒的內(nèi)部，針對(duì)NP蛋白的抗體檢出率也略低于針對(duì)其他3個(gè)蛋白的抗體檢出率，但針對(duì)4種不同抗原的抗體檢出率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

針對(duì)4種不同抗原的特異性抗體，重癥患者中IgM出現(xiàn)最早的是抗RBD-IgM和抗NP-IgM[10]，IgG出現(xiàn)最早的是抗NP-IgG；輕癥患者中，IgM出現(xiàn)最早的是抗RBD-IgM和抗ECD-IgM，IgG都出現(xiàn)在病程的第3周。針對(duì)S蛋白的抗體可能是具有保護(hù)性功能的中和抗體[11]，而針對(duì)NP蛋白的抗體并沒(méi)有中和病毒的能力。因此，雖然重癥患者血清中針對(duì)SARS-CoV-2的特異性抗體較高，但基本是針對(duì)NP蛋白的特異性抗體，可能在COVID-19疾病進(jìn)展中起到一定作用。

對(duì)COVID-19患者整個(gè)病程期間的病毒載量和抗體動(dòng)態(tài)變化模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同患者的病毒載量和抗體水平差異較大:有的患者血清中特異性抗體水平不斷升高，病毒載量水平也同時(shí)呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)甚至檢測(cè)不出，可見(jiàn)特異性抗體表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用；而有的患者體內(nèi)抗體水平上升較為緩慢，體內(nèi)的病毒載量在發(fā)病早期(第1周)就已經(jīng)下降或消失，此類(lèi)患者是否存在再次感染的風(fēng)險(xiǎn)，有待加大樣本量后的持續(xù)研究。

在發(fā)病第1周和第3周，重癥患者的SARS-CoV-2載量顯著高于輕癥患者，提示病毒載量可能是COVID-19重癥化的重要因素之一。通過(guò)重癥患者與輕癥患者的新冠抗體比較發(fā)現(xiàn)，總體上重癥患者血清中NP IgG和S1 IgG抗體水平高于輕癥患者，而輕癥和重癥患者血清中其他檢測(cè)的抗體水平相當(dāng)，這可能由于重癥患者體內(nèi)的病毒載量過(guò)高，導(dǎo)致新冠特異性抗體水平較高。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，個(gè)別康復(fù)期輕癥患者IgM和IgG抗體水平較低，此類(lèi)患者是否存在再次感染的風(fēng)險(xiǎn)，有待后續(xù)的長(zhǎng)期觀察。

本研究有一定的局限性，入組患者的數(shù)量?jī)H有19例，且本地未出現(xiàn)新冠死亡病例，故入組患者缺乏死亡病例。但針對(duì)4種不同抗原檢測(cè)其抗體，并結(jié)合患者體內(nèi)病毒載量的動(dòng)態(tài)水平進(jìn)行分析，這些數(shù)據(jù)可為SARS-CoV-2的抗體檢測(cè)、基于抗體的COVID-19患者治療策略以及疫苗的研發(fā)提供參考。