位 寧，郭進(jìn)艷，孫文利，王 磊*

(1 漯河市中醫(yī)院藥學(xué)部，漯河 462000；2 河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，廊坊 065201)

伊布替尼(ibrutinib)是一種高效、高選擇性的口服小分子布魯頓酪氨酸激酶(Brutons tyrosine kinase,BTK)抑制劑，通過選擇性地共價(jià)結(jié)合靶蛋白BTK活性中心的半胱氨酸殘基(Cys-481)結(jié)合位點(diǎn)，不可逆地抑制BTK活性和抑制B細(xì)胞抗原受體通路的激活，從而有效地阻止腫瘤細(xì)胞從B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到適合腫瘤生長的淋巴組織[1]。伊布替尼用于治療套細(xì)胞淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病[2]；口服吸收迅速，與血漿蛋白可逆性結(jié)合率為97.3%，達(dá)峰時(shí)間為 1～2 h，進(jìn)餐時(shí)的血藥濃度是空腹服藥時(shí)的2～4倍；主要通過肝臟CYP3A代謝，消除半衰期 4～6 h，主要以代謝物形式通過糞便排出體外[3]。研究證明[4-5]，伊布替尼藥動學(xué)個體差異大，且與強(qiáng)CYP3A抑制劑或強(qiáng)CYP3A誘導(dǎo)劑同時(shí)服用時(shí)，其暴露量將會受到影響[血藥濃度時(shí)間下面積(area under the curve，AUC)增加或減少10～20倍]?；颊咴谥委熯^程中易出現(xiàn)出血、高血壓等不良反應(yīng)或者療效不佳甚至治療失敗。臨床醫(yī)生在考慮患者依從性差、藥物相互作用等可能的原因之外，還應(yīng)考慮標(biāo)準(zhǔn)劑量是否為該患者的最佳治療劑量，是否實(shí)現(xiàn)了伊布替尼治療效益最大化。這就需要通過檢測血藥濃度來判斷患者體內(nèi)真實(shí)的藥物濃度，從而對患者進(jìn)行個體化治療，減少不良反應(yīng)[5]。國外文獻(xiàn)報(bào)道了伊布替尼血藥濃度測定的HPLC-MS/MS法[6-8],國內(nèi)目前尚無關(guān)于血液病患者伊布替尼血藥濃度檢測方法的報(bào)道。因此，本研究旨在建立測定血液病患者血漿中伊布替尼血藥濃度的HPLC-MS/MS法，并對此方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，確保建立的HPLC-MS/MS法可用于臨床常規(guī)監(jiān)測伊布替尼血藥濃度，為伊布替尼的個體化用藥劑量調(diào)整提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1儀器

島津LC-20A液相色譜串聯(lián)AB Sciex 4000 QTRAP型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；分析方法軟件為Analyst?MD 1.5.2。

1.1.2試藥

伊布替尼標(biāo)準(zhǔn)品(批號：1-JMO-111-1，Toronto Research Chemicals公司)；伊布替尼-d5標(biāo)準(zhǔn)品(批號：ZZS18062702，Toronto Research Chemicals公司)；伊布替尼膠囊(Pharmacyclics LLC，國藥準(zhǔn)字H20170350，規(guī)格140 mg)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司)；乙酸銨(分析純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司)；屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏蒸餾水有限公司)。

1.1.3基質(zhì)及臨床樣本

空白血漿基質(zhì)為新鮮小牛血清(北京百奧萊博科技有限公司)。收集本院5例服用伊布替尼的慢性淋巴細(xì)胞白血病患者的血液樣本，服藥劑量均為560 mg，qd，于給藥后2 h抽血檢測。

1.2 方法

1.2.1色譜條件

Ultimate XB-C18色譜柱(50 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫60 ℃，流動相為含2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸的水溶液(A)與含0.1%甲酸的甲醇溶液(B)，流速0.8 ml/min。梯度洗脫：0.0～0.5 min，95%B～25%B；0.5～2.0 min，25%B；2.0～2.5 min，25%B～95%B；2.5～3.0 min，95%B。進(jìn)樣量為1 μl。

1.2.2質(zhì)譜條件

在電噴霧正離子(ESI+)模式下，以多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式進(jìn)行檢測。離子源參數(shù)：離子噴射電壓5500 V，離子源溫度550 ℃，噴霧氣55 psi，輔助加熱氣55 psi，氣簾氣25 psi，碰撞氣medium。同時(shí)監(jiān)測伊布替尼m/z441.3～138.1(定量離子)，伊布替尼m/z441.2～304.1(定性離子)；伊布替尼-d5m/z446.2～138.1。質(zhì)譜條件見表1；伊布替尼和伊布替尼-d5的碎片離子質(zhì)譜圖見圖1。

表1 質(zhì)譜條件

A：伊布替尼；B：伊布替尼-d5圖1 伊布替尼與伊布替尼-d5的二級質(zhì)譜圖

1.2.3溶液的配制

1.2.3.1 儲備液的配制

精密稱取伊布替尼標(biāo)準(zhǔn)品5.000 mg，用甲醇溶解，多次洗滌，依次轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，再用甲醇定容，配制成濃度為0.5 mg/ml的儲備液。同樣精密稱取伊布替尼-d5標(biāo)準(zhǔn)品1.000 mg，用甲醇溶解，配制成濃度為0.1 mg/ml的儲備液，分裝，備用。

1.2.3.2 校準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的配制

取0.5 mg/ml的伊布替尼儲備液，用甲醇稀釋成濃度為0.1、0.2、1.0、2.0、10.0、20.0 μg/ml的伊布替尼系列校準(zhǔn)溶液。然后取伊布替尼-d5儲備液，用甲醇稀釋，制得濃度為0.25 μg/ml的伊布替尼-d5內(nèi)標(biāo)溶液，可沉淀血漿蛋白，作為樣本前處理液使用。

1.2.4樣本處理

取患者外周血樣本3500 r/min離心7 min，取100 μl血漿上清液于1.5 ml離心管中，加入100 μl含0.1%甲酸+2 mmol/L乙酸銨的水溶液，再加入300 μl伊布替尼-d5內(nèi)標(biāo)溶液，最后加入500 μl甲醇，渦旋60 s，充分混勻，13 000 r/min離心8 min。移取170 μl上清液于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣1 μl。

1.2.5方法學(xué)驗(yàn)證[9-14]

1.2.5.1 特異性考察

取屈臣氏蒸餾水直接進(jìn)樣，檢測，得色譜圖A。再取空白血漿100 μl，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按照“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，進(jìn)樣1 μl，得色譜圖B。將一定濃度的伊布替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液和伊布替尼-d5內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按照“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，進(jìn)樣1 μl，得色譜圖C。取受試者口服伊布替尼膠囊后的血漿樣品，按照“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，進(jìn)樣1 μl，得色譜圖D。比較色譜圖A、B、C、D，查看色譜峰保留時(shí)間，得出空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)是否干擾伊布替尼和伊布替尼-d5的檢測。

1.2.5.2 殘留驗(yàn)證

取濃度為20 μg/ml的伊布替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白屈臣氏蒸餾水樣品，按照“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，依次進(jìn)樣檢測。

1.2.5.3 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

通過評價(jià)目標(biāo)化合物在血漿基質(zhì)和無血漿基質(zhì)中的信號值來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。選取3個濃度(0.3、3.0、15.0 μg/ml)水平校準(zhǔn)液分別置于空白血漿和水中，按“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，通過血漿中目標(biāo)化合物(內(nèi)標(biāo))的信號強(qiáng)度與水中目標(biāo)化合物(內(nèi)標(biāo))的信號強(qiáng)度來計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子，進(jìn)而評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，計(jì)算公式參照《中國藥典》2020年版[10]。

1.2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

取10 μl濃度為0.1、0.2、1.0、2.0、10.0、20.0 μg/ml的伊布替尼系列校準(zhǔn)溶液分別加入1.5 ml離心管中，再平行加入90 μl空白血漿，按照“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理。經(jīng)HPLC-MS/MS分析。以伊布替尼與內(nèi)標(biāo)伊布替尼-d5峰面積之比作為縱坐標(biāo)(y)，以血漿伊布替尼濃度作為橫坐標(biāo)(x)，采用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸和線性擬合。連續(xù)測3天，每天1條標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過評價(jià)3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸的相關(guān)系數(shù)r2，要求r2≥0.9900。以S/N=10，計(jì)算定量限。

1.2.5.5 精密度

取空白血漿，分別加入一定體積的伊布替尼儲備液，制備高、中、低(1.50、0.30、0.03 μg/ml)3種濃度的質(zhì)量控制(QC)樣品，按“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理。每一濃度進(jìn)行6個樣本分析，連續(xù)測定3天。根據(jù)當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品的測定濃度，根據(jù)QC樣品的測定濃度計(jì)算精密度，要求變異系數(shù)(CV)<15%。

1.2.5.6 回收率

取空白血漿，制備高、中、低(1.50、0.30、0.03 μg/ml)3種濃度的QC血漿樣品，各6份。按“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，經(jīng)HPLC-MS/MS分析，得到分析物伊布替尼及內(nèi)標(biāo)伊布替尼-d5峰面積之比A1。另取空白血漿，經(jīng)蛋白沉降處理得血漿上清液，制備高、中、低(1.50、0.30、0.03 μg/ml)3種濃度的QC血漿上清液樣品，各6份。按“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，經(jīng)HPLC-MS/MS分析，得到分析物伊布替尼及內(nèi)標(biāo)伊布替尼-d5峰面積之比A2。以A1/A2比值計(jì)算回收率。

1.2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制伊布替尼高、中、低(1.50、0.30、0.03 μg/ml) 3種濃度的血漿樣品，按“1.2.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，每個濃度3個樣品，考察其在室溫放置24 h、4 ℃冰箱放置24 h、24 h內(nèi)反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 特異性考察

由圖2可見，伊布替尼保留時(shí)間為2.06 min，伊布替尼-d5保留時(shí)間為2.06 min，二者色譜行為一致。說明伊布替尼-d5作為伊布替尼的內(nèi)標(biāo)較為合適；亦表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾伊布替尼和內(nèi)標(biāo)伊布替尼-d5的測定，專屬性良好。

A：空白水；B：空白血漿；C：空白血漿+伊布替尼+伊布替尼-d5；D：患者血漿+伊布替尼-d5圖2 空白水、空白血漿、伊布替尼和伊布替尼-d5色譜圖

2.2 殘留驗(yàn)證

高濃度樣品后伊布替尼的第一個空白樣品的殘留為15.60%，第二個空白樣品的殘留為4.30%，均小于分析物定量下限20%；高濃度樣品后伊布替尼-d5的第一個空白樣品的殘留為0.10%，第二個空白樣品的殘留為0.07%，低于內(nèi)標(biāo)峰面積的5%。見表2。

表2 伊布替尼殘留實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

有血漿和無血漿基質(zhì)中不同加標(biāo)濃度伊布替尼的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子在0.99～1.02之間，CV在1.57%～3.67%之間，小于15%，符合《中國藥典》2020年版[10]要求。見表3。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，得到直線方程y=0.004 64x+0.004 42，r2=0.9997。表明伊布替尼在10～2000 ng/ml內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為1.65 ng/ml。見表4。

表4 伊布替尼標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

2.5 精密度

伊布替尼日內(nèi)RSD為2.84%～5.41%，日間RSD為4.89%～5.19%，二者均小于15%。表明精密度好，數(shù)據(jù)較集中。見表5。

表5 伊布替尼精密度測定結(jié)果 n=6

2.6 回收率

通過計(jì)算A1/A2比值，得到回收率為101.31%～102.54%，位于85%～115%之間，準(zhǔn)確度較高。見表6。

表6 伊布替尼回收率測定結(jié)果 n=6

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在相應(yīng)考察的穩(wěn)定性條件下，對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，伊布替尼穩(wěn)定性數(shù)據(jù)RSD 0.38%～2.93%，小于15%。表明伊布替尼樣品較為穩(wěn)定，在血中穩(wěn)定性好，可進(jìn)行臨床常規(guī)血藥濃度檢測。見表7。

表7 伊布替尼穩(wěn)定性結(jié)果

2.8 臨床應(yīng)用

應(yīng)用上述建立的檢測伊布替尼血藥濃度的HPLC-MS/MS法，對5例患者伊布替尼血藥濃度進(jìn)行檢測。結(jié)果為：13.2、3.07、7.7、13.3、254 ng/ml，可見服用同一劑量的不同患者的伊布替尼血藥濃度不同，且前4例患者結(jié)果都低于正常值37.1 ng/ml[4]。最后1例患者濃度明顯偏高。經(jīng)詢問，該患者服用了伏立康唑作為抗感染預(yù)防用藥。伏立康唑?yàn)镃YP3A4抑制劑，導(dǎo)致伊布替尼血藥濃度偏高[5]。

3 討論

HPLC-MS/MS可在較短時(shí)間內(nèi)完成待測物的檢測，且具有良好的靈敏度和特異性，成為各種藥物體外研究和體內(nèi)分析的首選方法[9]。在伊布替尼的臨床前和臨床研究過程中，對生物基質(zhì)中藥物的定量研究是非常有必要的。Veeraraghavan等[6]在2015年采用甲苯磺丁脲作為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)監(jiān)測大鼠血清中來那度胺、伊布替尼及其代謝產(chǎn)物。由于選用色譜柱較長，導(dǎo)致出峰時(shí)間延長，檢測耗時(shí)；選用乙腈作為洗脫劑，提取回收率為75.2%。Beauvais等[7]在2018年建立了同時(shí)檢測腦脊液中伊布替尼及其代謝產(chǎn)物的UHPLC-MS/MS法，采用乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫，色譜柱短，出峰時(shí)間快，但其線性范圍較窄。Sun等[8]在2019年采用UPLC-ESI-MS/MS法檢測套細(xì)胞淋巴瘤大鼠血漿中伊布替尼濃度，采用維拉佐酮作為內(nèi)標(biāo)，其出峰時(shí)間(0.73 min)與伊布替尼出峰時(shí)間(0.51 min)不一致，明顯延后，不利于臨床樣本(血清基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)種類多等)檢測。

本研究建立的測定伊布替尼血藥濃度的HPLC-MS/MS法，采用同位素伊布替尼-d5作為內(nèi)標(biāo)，能一定程度降低生物基質(zhì)對伊布替尼含量測定的影響。以甲酸-乙酸銨作為緩沖鹽，甲醇-水梯度洗脫，基質(zhì)無干擾，出峰時(shí)間早，峰型好，且前處理簡單，回收率及精密度和穩(wěn)定性均較好，線性范圍適宜，可用于臨床常規(guī)伊布替尼血藥濃度測定。但在實(shí)驗(yàn)過程中，QC低濃度點(diǎn)準(zhǔn)確度和方法回收率雖然符合《中國藥典》2020年版規(guī)定范圍，但相對偏高，可能與伊布替尼離子對選擇有關(guān)。

在對伊布替尼離子+NH3、+Na、+K峰進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)其子離子不穩(wěn)定或者子離子峰響應(yīng)低，不能作為常規(guī)檢測離子選用。對洗脫梯度和溶劑及色譜柱進(jìn)行考察，亦發(fā)現(xiàn)不能消除此種現(xiàn)象。故選擇本實(shí)驗(yàn)室常用色譜系統(tǒng)對伊布替尼血藥濃度進(jìn)行臨床常規(guī)檢測[15]。本研究建立的測定人血漿中伊布替尼血藥濃度的HPLC-MS/MS法，可以常規(guī)測定伊布替尼血藥濃度，為伊布替尼的個體化合理用藥提供支持。由于價(jià)格原因，本院目前服用伊布替尼的患者少，伊布替尼血藥濃度與臨床療效的研究還需后續(xù)臨床病例的增加而逐步開展。