石 赟, 陳艷蓉, 張 凈, 羅 佳

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科, 北京, 100050)

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種轉(zhuǎn)錄長度>200 bp, 但無蛋白編碼功能的核苷酸序列。大量研究[1-3]證實(shí), LncRNA與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生理過程密切相關(guān)。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以不完全氣流受限為特征的進(jìn)展性疾病，有效評估COPD急性加重期(AECOPD)患者病情并預(yù)測其預(yù)后在AECOPD治療中具有重要意義[4-6]。徐建光等[7]研究發(fā)現(xiàn), COPD患者外周血單個核細(xì)胞中長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因3 (LncRNA SNHG3)表達(dá)水平下降，且推測LncRNA SNHG3表達(dá)量降低可能是COPD發(fā)病的重要原因。由此推測, LncRNA水平的改變可能與COPD患者病情及預(yù)后存在一定關(guān)系。本研究將長鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3(LncRNA MEG3)及小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)納為研究指標(biāo)，通過檢測87例AECOPD患者血清LncRNA MEG3、SNHG5水平分析其在判斷患者病情及預(yù)后中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2017年6月—2020年6月收治的87例AECOPD患者納為急性組，將急性組中經(jīng)治療1個月后病情恢復(fù)穩(wěn)定的46例患者納為穩(wěn)定組，同期50例健康志愿者納為對照組。① 急性組入選標(biāo)準(zhǔn): 患者符合《慢性阻塞性肺病全球倡議慢性阻塞性肺病指南(2013更新版)》[8]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，具有呼吸困難、慢性咳嗽咳痰癥狀，持續(xù)性氣流受限，短期內(nèi)咳嗽、喘息、咳痰等癥狀加重，需改變治療方案。② 穩(wěn)定組入選標(biāo)準(zhǔn): 上述AECOPD患者經(jīng)治療后病情基本恢復(fù)至急性加重前狀態(tài)，病情穩(wěn)定1個月以上。③ 健康志愿者入選標(biāo)準(zhǔn): 健康志愿者無COPD病史，無慢性咳嗽、咳痰、喘息等病史。排除標(biāo)準(zhǔn): 入院前2周內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素或抗菌藥物治療者、合并其他部位感染者、合并惡性腫瘤者、合并嚴(yán)重免疫缺陷性疾病者和認(rèn)知障礙者。急性組男71例，女16例; 年齡59～88歲，平均(72.56±12.62)歲; 合并高血壓者22例，合并糖尿病者13例。穩(wěn)定組男36例，女10例; 年齡56～85歲，平均(71.58±13.57)歲; 合并高血壓者10例，合并糖尿病者7例。健康對照組男40例，女10例; 年齡58～87歲，平均(70.58±15.36)歲; 合并高血壓者9例，合并糖尿病者6例。

1.2 血液樣本采集

分別在COPD患者急性加重期及穩(wěn)定期采集外周靜脈血，對照組采用體檢廢棄血清。采用促凝管采集被研究者靜脈血5 mL, 室溫下靜置30 min, 1 500轉(zhuǎn)/min離心10 min, 收集上層液體置于EP管內(nèi), -80 ℃冰箱中保存待用。

1.3 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測血清LncRNA表達(dá)

采用TRIzol提取血清中總RNA, 利用Thermofisher公司生產(chǎn)的NanoDrop ND1000分光光度計(jì)檢測RNA濃度與純度?？俁NA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄處理得到cDNA。RT-qPCR法檢測血清SNHG5與內(nèi)參基因磷酸脫氫酶(GAPHD)的表達(dá)，反應(yīng)體系為: Mix 10 μL, 上下游引物各1 μL, cDNA 2 μL, 焦碳酸二乙酯(DEPC)水6 μL。PCR擴(kuò)增條件: 第1階段95 ℃,5 min, 第2階段95 ℃, 30 s, 持續(xù)35個循環(huán)，每組樣品重復(fù)3次?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-△△α法計(jì)算。引物序列見下: GAPHD正向引物為5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′; GAPHD反向引物為5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′; MEG3正向引物為5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′; MEG3反向引物為5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′; SNHG5正向引物為5′-TACTGGCTGCGCACTTCG-3′; SNHG5反向引物為5′-CAGTAAAAGGGGAACACCA-3′。

1.4 COPD患者病情及預(yù)后相關(guān)指標(biāo)檢測

① 檢查患者病情相關(guān)指標(biāo): 收集患者一般資料，包括吸煙史、COPD病程、住院時間、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1), 計(jì)算第1秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值(FEV1/FVC)、第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%預(yù)計(jì)值)。② GOLD分級參考《慢性阻塞性肺病全球倡議慢性阻塞性肺病指南(2013更新版)》標(biāo)準(zhǔn)[8], 共分為4級，分級越高說明患者病情越嚴(yán)重。COPD多維分級評分系統(tǒng) (BODE)指數(shù)包含體質(zhì)量指數(shù)、氣流阻塞程度、呼吸困難程度及運(yùn)動能力等指標(biāo)，得分與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。③ AECOPD患者預(yù)后評估: 將住院期間死亡的AECOPD患者納為預(yù)后不良組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 3組臨床資料比較

急性組、穩(wěn)定組及對照組男女占比、年齡、FEV1%預(yù)計(jì)值水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 3組吸煙史、WBC及FEV1/FVC水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。急性組住院時間長于穩(wěn)定組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 急性組和穩(wěn)定組COPD病程比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組臨床資料比較

2.2 3組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平比較

急性組及穩(wěn)定組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平均低于對照組，且急性組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平低于穩(wěn)定組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平比較

2.3 急性組及穩(wěn)定組GOLD分級及BODE指數(shù)得分比較

急性組GOLD分級與穩(wěn)定組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 急性組BODE指數(shù)得分高于穩(wěn)定組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 急性組及穩(wěn)定組GOLD分級及BODE指數(shù)得分比較

2.4 血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與COPD患者不良預(yù)后的關(guān)系分析

87例AECOPD患者住院期間共死亡18例，被納入預(yù)后不良組，其余69例被納入預(yù)后良好組。預(yù)后不良組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平低于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與COPD患者不良預(yù)后的關(guān)系分析

2.5 血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與COPD患者其他指標(biāo)間的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析提示, COPD患者血清LncRNA MEG3與吸煙史、GOLD分級、BODE指數(shù)得分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05), 與FEV1/FVC水平呈正相關(guān)(P<0.05)。LncRNA SNHG5水平與吸煙史、住院時間、GOLD分級及BODE指數(shù)得分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05), 與FEV1/FVC呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討 論

COPD是全球患者死亡的主要病因，但關(guān)于COPD的致病機(jī)制目前尚不清楚。研究認(rèn)為, COPD與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬、細(xì)胞凋亡等相關(guān)。隨著全球分子研究的不斷進(jìn)展, LncRNA被證實(shí)是一種與細(xì)胞增殖、凋亡等生理過程密切相關(guān)的物質(zhì)，成為了目前研究[9-10]的焦點(diǎn)。

本文通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn), MEG3、SNHG5 2種LncRNA與肺部病變有關(guān)。鄭志剛等[11]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中LncRNA MEG3表達(dá)低于癌旁組織，且其表達(dá)量影響患者生存時間，可作為肺癌預(yù)后判斷的潛在分子標(biāo)志物。薛明強(qiáng)等[12]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), LncRNA MEG3能調(diào)節(jié)肺癌H1299細(xì)胞對放射的敏感性。陳剛等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血清LncRNA SNHG5水平在診斷非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中具有良好的靈敏性及特異性。以上研究證實(shí), LncRNA MEG3及SNHG5可能參與肺癌的發(fā)生及發(fā)展，推測2種指標(biāo)可能與COPD也存在一定的關(guān)聯(lián)性。

本研究比較3組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平發(fā)現(xiàn)，急性組、穩(wěn)定組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平均低于對照組，且急性組患者血清LncRNA MEG3、SNHG5水平低于穩(wěn)定組患者，提示LncRNA MEG3、SNHG5可能參與AECOPD的發(fā)生過程。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與COPD患者GOLD分級及BODE指數(shù)得分均呈負(fù)相關(guān)，與FEV1/FVC呈正相關(guān)，提示血清LncRNA MEG3、SNHG5在反映患者病情嚴(yán)重程度中也具有良好的應(yīng)用價值。

研究[14-15]表示，煙草中有害物質(zhì)會損傷氣道上皮細(xì)胞與纖毛運(yùn)動，降低氣道凈化能力，并促進(jìn)支氣管黏液腺與杯狀細(xì)胞增生肥大，分泌更多黏液，同時刺激副交感神經(jīng)，促進(jìn)平滑肌收縮。此外，尼古丁等有害物質(zhì)還能促使自由基的生成，誘導(dǎo)中心粒細(xì)胞釋放蛋白酶，破壞肺纖維彈力，誘導(dǎo)肺部病變。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者血清LncRNA MEG3、SNHG5水平與患者吸煙史密切相關(guān)，推測LncRNA MEG3、SNHG5可能參與了COPD的進(jìn)展。

本研究87例AECOPD患者中共18例住院期間死亡，將其納入預(yù)后不良組。預(yù)后不良組與預(yù)后良好組治療前血清LncRNA MEG3、SNHG5水平比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良組血清LncRNA MEG3、SNHG5水平低于預(yù)后良好組，提示血清LncRNA MEG3、SNHG5在反映COPD患者預(yù)后中也具有一定的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述, COPD患者血清LncRNA MEG3、SNHG5水平較健康者下降，且與患者肺功能及病情嚴(yán)重程度有關(guān)，在判斷AECOPD患者短期內(nèi)再次急性復(fù)發(fā)中也具有一定價值。