張琬玥，劉 瑋，徐 航，高向東

（中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 210009）

腫節(jié)風多糖SGP-2是本課題組從腫節(jié)風全草中提取、分離純化得到的一種結構復雜且生物學活性多樣的酸性多糖［1］。體內外實驗結果表明，SGP-2通過抑制α-葡萄糖苷酶而具有良好的降血糖活性［2-3］。多糖結構的復雜性，限制了其作用機制的闡釋及構效關系的研究，也是進一步開發(fā)多糖類藥物普遍存在的瓶頸問題。而多糖結構作為活性的基礎及構效關系中關鍵的角色，近年來隨著研究技術的進步不斷被推動。隨著多糖結構信息的揭示，其生物活性評價及作用機制的探究及構效關系的闡釋都將得到推進。作為一類重要的生物大分子，與蛋白質和核酸一樣，多糖的結構又分為一級結構及高級結構［4-5］，而高級結構又對其活性影響起到至關重要的作用。目前高效液相-動態(tài)光散射法/靜態(tài)光散射法［6］、透射電子顯微鏡分析（TEM）［7］、原子力顯微鏡分析（AFM）［8］等都是對多糖高級結構研究較常見的研究方法，將多種技術相結合可以更全面地開展對多糖高級結構及構效關系的研究。多糖高級構象變化對生物學活性的影響逐漸被科研工作者關注，如香菇多糖的抗腫瘤活性會伴隨著三螺旋結構的解鏈而消失［9］。另外，不同的溶液環(huán)境使分子間作用力發(fā)生改變，也會導致多糖的構象發(fā)生變化從而影響其生物學活性［10-11］。

因此，本研究采用激光粒度分析、TEM和AFM等技術對腫節(jié)風酸性多糖SGP-2的高級結構進行了解析。采用不同處理方法改變了多糖SGP-2的空間構象，并初步探討了SGP-2不同高級結構與α-葡萄糖苷酶抑制活性的關系，為多糖結構解析提供新思路，為將其開發(fā)成藥物及尋找類似生物活性的多糖提供了理論依據。

1 材料

1.1 試 劑

腫節(jié)風多糖SGP-2（相對分子質量1 880 kD，本實驗室自制，經高效凝膠過濾色譜檢測為單個對稱峰的均一多糖［1］）；4-硝基苯-β-D-葡萄糖苷（pNPG）、來自釀酒酵母的α-葡萄糖苷酶（美國Sigma-Aldrich公司）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀 器

Multiskan全波長酶標儀（美國Thermo公司）；Easysizer20激光粒度分析儀（珠海歐美克儀器有限公司）；SP13800原子力顯微鏡、JEM2100透射電子顯微鏡（日本電子株會社）；KH5200DB超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 腫節(jié)風多糖SGP-2高級結構解析

2.1.1 激光粒度分析 稱取多糖樣品SGP-2 5 mg置于25 mL茄形瓶中，加入蒸餾水或0.05 mol/L Na2SO4溶液10 mL攪拌過夜，臨用前用超聲清洗器100 W超聲10 min，置于比色皿中用激光粒度分析儀掃描，每個樣品重復3次。

2.1.2 透射電子顯微鏡（TEM）分析 稱取多糖樣品SGP-2 10 mg置于10 mL茄形瓶中，加入蒸餾水或0.05 mol/L Na2SO4溶液5 mL配制為質量濃度為2 mg/mL的溶液，磁力攪拌過夜，80℃加熱2 h，臨用前用超聲清洗器100 W超聲10 min，0.45μm濾膜過濾。將樣品溶液滴加到200目銅網上，用磷鎢酸染色并干燥，當儀器電壓升高到80 kV時，用鑷子將銅網置于電子槍上并插入樣品室中，通過調焦系統選擇適當視野拍照記錄結果。

2.1.3 原子力顯微鏡分析 稱取多糖樣品SGP-2 10 mg置于10 mL茄形瓶中，加入蒸餾水5 mL溶解后磁力攪拌過夜，蒸餾水對樣品進行梯度稀釋至終濃度為10μg/mL，0.45μm濾膜過濾。將稀釋后的樣品溶液滴在新剝離的云母片上，室溫干燥后立即置于金屬樣品臺中。調整樣品與探針之間的距離并控制在1~2 mm范圍內，圖像測量方式設置為DFM輕敲模式，掃描速度為0.8 Hz，獲取AFM圖像。圖像及測量數據采用Nanoscope V Multimode 8軟件進行分析。

2.2 腫節(jié)風多糖SGP-2構效關系的初步研究

2.2.1 SGP-2及其衍生物在不同條件處理下的樣品制備

物理處理：（1）以不同濃度的尿素（0.5，1，2，4，8，10 mol/L）為溶劑將SGP-2配制成0.5 mg/mL或1 mg/mL的溶液后在4℃放置24 h，再設置另一組如上處理后通過透析去除尿素；（2）將SGP-2配制成0.5 mg/mL或1 mg/mL的溶液轉移至淚滴型安培管中抽真空封口，分別放置于不同溫度（100，120，140℃）的油浴中加熱1 h并于4℃保存24 h。

脫甲酯：將多糖SGP-2配成3 mg/mL多糖溶液，50℃加熱溶解。用NaOH調pH至12并維持24 h，使其發(fā)生皂化反應脫去甲酯，再用HCl中和至pH為7。反應液用8~14 kD透析袋透析48 h，減壓濃縮至40 mL并加入4倍體積無水乙醇醇沉過夜，離心，取沉淀進行真空干燥后命名為SGP-2T。

羧基還原：稱取多糖樣品SGP-2 80 mg溶于雙蒸水30 mL，用鹽酸調pH至4.75，加入碳化二亞胺固體766.8 mg對羧基進行活化并在該pH條件下維持45 min。反應結束后用鹽酸調pH為9.0并在維持3 h的同時緩慢加入硼氫化鈉固體3.6 g，反應結束后再用鹽酸將pH調回7.0。滴入少量濃鹽酸觀察是否有氣泡產生，從而判斷反應是否完全。將還原產物用8~14 kD透析袋透析48 h，截留液減壓濃縮至3.5 mL，加入無水乙醇14 mL過夜，4 000 r/min離心10 min，沉淀用無水乙醇洗滌2次后干燥后命名為SGP-2H。

2.2.2 高級結構分析 按“2.1.1”和“2.1.2”項下操作，使用激光粒度分析儀和TEM研究“2.2.1”項不同處理條件下SGP-2及其衍生物高級結構的變化，以相同濃度未經過任何處理的SGP-2水溶液為對照。

2.2.3α-葡萄糖苷酶活性的測定 用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）將處于不同溶劑、加熱處理、脫甲酯及羧基還原處理的SGP-2及其衍生物樣品配制成1 mg/mL溶液，梯度稀釋至終濃度分別為15.63，31.25，62.5，125，250，500和1 000μg/mL。樣品160μL和α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）20μL混合后置于37℃孵育10 min，再加入底物5 mmol/LpNPG溶液20μL混勻后在37℃孵育30 min。以相同濃度未經過任何處理的SGP-2為陽性對照，以PBS代替樣品作為空白對照，每組設置3個平行，測定405 nm的吸收度。計算樣品的抑制率，抑制率（%）=（樣品吸收度-以PBS代替α-葡萄糖苷酶時反應體系吸收度）/PBS代替樣品時反應體系的吸收度×100。

數據由Graphpad Prism 8.0軟件進行統計學處理，采用Two-Way ANOVA比較分析。

3 結果

3.1 腫節(jié)風多糖SGP-2高級結構解析

3.1.1 激光粒度分析 使用激光粒度分析儀測得腫節(jié)風多糖SGP-2在水中直徑為（147.1±3.0）nm，粒徑分布為0.157；在0.05 mol/L Na2SO4中直徑為（91.6±2.5）nm，粒徑分布為0.260。無論是在水溶液還是在鹽溶液中粒徑分布范圍均較窄，小于0.3，表明腫節(jié)風多糖SGP-2均一性較好［12］。與在水中相比SGP-2在鹽溶液中粒徑明顯降低，這可能是由于Na+離子的存在中和了SGP-2羧基所帶的負電荷，減少了多糖分子間的排斥作用。

3.1.2 TEM分析TEM結果如圖1所示，在水溶液中SGP-2多數以聚集體的形式存在（圖1-A），這可能由于多糖分子之間或者多糖與水分子之間存在氫鍵或者范德華力，為分子的聚集提供支撐作用［13-14］。相反，在視野邊緣地區(qū)有少量SGP-2濃度相對較低，分子分散性較好，主要表現為周邊光滑的圓形顆粒（圖1-B）。在鹽溶液中，SGP-2的聚集體明顯減少，部分伴隨分支形態(tài)（圖1-C），集中呈現出圓形結構（圖1-D）。而TEM數據統計出的粒徑大小，相同濃度的SGP-2在純水中的直徑為155 nm，在鹽溶液中的粒徑為80 nm，這種尺寸的略微減小可能是由于鹽離子的存在破壞了多糖分子內或分子間的相互作用力如靜電排斥作用從而導致解聚現象的發(fā)生，或是可能歸因于銅網對大分子的吸附作用［15］。

3.1.3 AFM分析SGP-2的三維AFM結果如圖2所示。經過數據統計及軟件分析，SGP-2的平均直徑為33 nm，測算得到的粒徑大小與TEM結果在一個數量級。另外軟件分析計算出多糖分子的平均高度為1.84 nm，而單鏈多糖分子的平均高度為0.1~1.0 nm［16］，也證明了SGP-2在純水中發(fā)生了聚集現象，與TEM結果一致。

Figure 1 Transmission electron microscope(TEM)images of polysaccharide SGP-2 extracted from Sarcandra glabra

3.2 腫節(jié)風多糖SGP-2構效關系的初步研究

3.2.1 SGP-2及其衍生物在不同條件處理下的高級結構分析 采用不同的處理方法得到了高級結構發(fā)生變化的SGP-2及其衍生物，尿素處理對SGP-2粒徑及粒徑分布的影響如表1所示。氫鍵被認為是多糖構象變化的主要驅動力之一［17］，隨著尿素濃度的升高，SGP-2的分子粒徑逐漸增大，這可能因為尿素的存在破壞了SGP-2分子內或分子間的氫鍵，促使分子間相互作用力減弱，分子內部結構松散。采用透析的方法去除尿素后，低濃度尿素被透析后SGP-2粒徑基本恢復，而當尿素濃度增加至1 mol/L以上，透析后SGP-2的粒徑并沒有完全恢復。這可能因為低濃度尿素對氫鍵的破壞力相對較弱，隨著濃度的升高，尿素促使多糖與水分子之間氫鍵的斷裂，多糖內部的疏水殘基伸展，粒徑變大，而且部分尿素可以轉變?yōu)榍杷猁}，氰酸鹽的存在可能改變多糖分子的表面電荷，從而導致部分構象透析后沒有完全恢復［18］。經過高溫加熱的SGP-2粒徑明顯隨著溫度升高而增大，在100℃時粒徑為（181.3±1.6）nm，粒徑分布為0.255；在120℃時粒徑為（206.0±7.5）nm，粒徑分布為0.288；并最終在140℃達到（208.2±4.6）nm，粒徑分布為0.249。這可能因為分子間氫鍵發(fā)生斷裂，游離的糖鏈之間相互交替、纏繞所致。由此可見，溶液環(huán)境的變化顯著影響SGP-2的粒徑大小。而脫甲酯的SGP-2衍生物在水溶液中的粒徑變大，其直徑可達（522.6±3.5）nm，粒徑分布為0.404。這可能因為脫甲酯會暴露出部分羧基，游離的羧基促使分子內或分子間氫鍵增多，分子聚集。羧基還原后的SGP-2衍生物粒徑也變大，直徑為（222.1±3.8）nm，粒徑分布為0.264。原因可能在于羧基的減少使得分子間相互作用力減弱，糖鏈展開，結構松散。

Table 1 Effects of urea on the diameter distributions of SGP-2(±s,,n=3)

Table 1 Effects of urea on the diameter distributions of SGP-2(±s,,n=3)

c(Urea)/(mol/L)0.5 1248 10 0.5 1 2 4 8 10 Dialysis------++++++Particle diameter/nm 197.5±1.9 227.4±13.4 237.4±8.6 246.0±3.6 420.1±4.4 499.3±13.7 153.1±5.1 155.3±1.6 182.3±3.1 184.4±3.0 187.0±1.6 188.1±2.8 Size distribution 0.260 0.226 0.190 0.229 0.302 0.294 0.169 0.219 0.172 0.173 0.198 0.222

將粒徑發(fā)生顯著變化的樣品用TEM進行觀察，結果如圖3所示。經低濃度尿素（0.5 mol/L）處理過的SGP-2透析后去除誘因，其水溶液形貌為50 nm左右的內部具有少量空穴的球體（圖3-A），與未經任何處理的SGP-2構象具有較高的相似性。而經高濃度尿素處理過的SGP-2水溶液并沒有恢復原始形貌，而是受分子間或分子內氫鍵斷裂、分子間作用力減弱等因素的影響，原本緊密結合的球體結構發(fā)生擴散，糖鏈之間形成有規(guī)則的稀疏的氫鍵及范德華等作用力，從而聚集成具有卵圓形空穴的網格形態(tài)（圖3-B）。經不同溫度加熱處理的SGP-2水溶液也會具有不同的形貌（圖3-C、D）。100℃加熱后，SGP-2形成致密網格，而140℃的加熱處理為氫鍵的進一步斷裂提供了足夠能量，促使糖鏈之間的氫鍵幾乎完全斷裂，最終形成具有分支的桿狀結構。羧基還原這一化學反應對分子形態(tài)的影響較大，羧基還原后的衍生物SGP-2H高級結構松散，糖鏈之間相互交疊、纏繞形成特征性較為明顯的纏結鏈，可能由于分子間氫鍵較少。這與香菇多糖在TEM表現出的三螺旋結構有些相似［18］，同時SGP-2H呈現出明顯的高分支狀態(tài)（圖3-E）。而脫甲酯后的衍生物SGP-2T與SGP-2相比，游離的羧基增多，分子內及分子間的氫鍵及分子間作用力明顯增大，導致分子的聚集程度變大，但由于SGP-2結構中甲酯度相對較低，并沒有對結構產生明顯的影響，SGP-2T仍表現為緊密的聚集球體（圖3-F）。

Figure 3 Morphology of SGP-2 after different treatment

3.2.2α-葡萄糖苷酶活性的測定 采用不同的處理方法改變多糖SGP-2的高級構象后，對其不同的高級結構與α-葡萄糖苷酶體外抑制活性間關系進行了初步探究。結果如圖4-A可知，經尿素處理的SGP-2都表現出α-葡萄糖苷酶抑制活性，并呈劑量依賴性。與未經處理的SGP-2相比，0.5 mol/L尿素處理后的SGP-2在1 000μg/mL下抑制率可達未處理SGP-2抑制率的98.8%。而經10 mol/L尿素處理的SGP-2抑制活性明顯降低，在62.5μg/mL下抑制率僅有原SGP-2抑制率的28.5%。如圖4-B所示高溫處理后的SGP-2對糖苷酶抑制活性明顯升高，且溫度越高，活性越強，原因可能在于加熱促使多糖分子間或分子內氫鍵斷裂，暴露出某些活性基團［19］。經140℃處理的SGP-2于1 000μg/mL下抑制率高達83.3%，高于同濃度下原型SGP-2的抑制率（72.7%）。圖4-C表明SGP-2脫去甲酯后的衍生物活性有所提高，在1 000μg/mL下抑制率為77.7%，推測可能是由于甲酯的去除使得空間位阻減小，暴露出部分活性位點，有利于SGP-2與α-葡萄糖苷酶的相互作用。而羧基還原的SGP-2衍生物活性明顯降低，由此推測糖醛酸在SGP-2與α-葡萄糖苷酶結合過程中發(fā)揮重要作用。

Figure 4 Inhibition activity of on SGP-2α-glycosidase at different conditions in vitro(±s,,n=3)

4 討論

本研究顯示經0.5 mol/L尿素處理并透析的SGP-2以及脫甲酯的SGP-2衍生物在電鏡下呈現出的球形結構有助于與α-葡萄糖苷酶的結合。而經高溫處理的SGP-2形成網格結構甚至進一步斷裂網格形成短桿狀，且處理溫度越高活性越強，由此推測游離的羥基及羧基有助于SGP-2與酶蛋白的相互作用，這可能與氫鍵的形成有關。SGP-2經羧基還原后的衍生物呈現相互纏結纖維狀構象，抑制活性顯著下降，推測可能因舒展的結構造成糖鏈的長度增加，導致無法進入酶蛋白的活性區(qū)域。另外，高濃度尿素及加熱處理后雖同為網格形態(tài)，但對α-葡萄糖苷酶的抑制活性卻區(qū)別很大，這可能因為高濃度的尿素導致SGP-2表面電荷發(fā)生改變，與酶蛋白之間的離子鍵減弱，結合能力降低。本研究僅通過體外α-葡萄糖苷酶抑制活性初步研究了SGP-2的構效關系，后續(xù)實驗將通過動物實驗進一步討論不同構象的SGP-2在體內的降糖活性。