吳伊玲，尤 琪，吳 潔

（中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院，南京 211198）

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1D）是一種自身免疫性疾病，表現(xiàn)為機體對胰腺抗原成分免疫欠耐受，自身反應性T細胞對胰腺β細胞產(chǎn)生免疫性破壞，導致胰島素分泌絕對不足［1-2］。一旦發(fā)病，患者需要終身使用外源胰島素并定期監(jiān)測血糖水平。重建機體對自身抗原的免疫耐受是研制相關(guān)疫苗防治T1D的關(guān)鍵。

在疫苗開發(fā)方面，抗原表位的選擇十分重要，需要選擇相關(guān)抗原分子上合適的抗原肽。谷氨酸脫羧酶65（glutamic acid decarboxylase 65，GAD65）為T1D自身抗原，谷氨酸脫羧酶抗體（GADA）是T1D最早出現(xiàn)且陽性率最高的自身抗體，是非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠由外周胰腺炎發(fā)展為內(nèi)部浸潤的關(guān)鍵靶點［3］。給雌性NOD小鼠注射外源性GAD65，可以明顯降低其T1D發(fā)病率［4］。GAD65敲除的NOD小鼠發(fā)生T1D的概率顯著降低且發(fā)病時間明顯推后［5］。臨床研究顯示，GAD65明礬制劑（或聯(lián)合維生素D）免疫可以維持患者β細胞功能，改善T1D的臨床指標［6-7］。

實驗室前期選擇GAD65中與疾病發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵表位肽段（p217~236，p524~538，p290~306）形成的靶抗原組合肽GADIII作為分子組分，使用霍亂毒素B亞基（cholera toxin subunit B，CTB）作為佐劑分子，成功構(gòu)建得到原核表達重組菌株E.coliBL21-pET28a：CTB-GADIII［8］，誘 導 表 達 獲得的融合蛋白CTB-GADIII滴鼻免疫NOD小鼠可以顯著降低T1D發(fā)病率。

臨床上疫苗的給藥方式大多為注射，其次為滴鼻，而口服制劑由于胃腸道復雜的生理環(huán)境限制了其開發(fā)，但近年來也有很多成功的嘗試和報道［9-10］。

海藻酸鈉（sodiumalginate，SA）分子中含有大量的羧基，具有一定的生物黏附性，屬于黏膜黏附性納米材料，能夠保護多肽蛋白不受胃酸的破壞。此外，制備成的納米粒能夠持續(xù)緩慢地在腸黏膜部位釋放，通過M細胞將樹突延伸至腔內(nèi)捕獲抗原［11］，這為藥物或疫苗的靶向輸送提供了可能性。本研究嘗試應用海藻酸鹽作為載體制備口服納米疫苗制劑，靶向腸道進行免疫誘導，進而防治T1D。參考相關(guān)研究［12］，使用溶劑擴散法制備了GADIII-海藻酸鈣納米粒（Ca-Alg-GADIII）。以多次小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導的T1D小鼠模型為研究對象，考察口服疫苗Ca-Alg-GADIII對T1D小鼠的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

STZ（美國Sigma公司）；抗小鼠胰島素抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；小鼠ELISA試劑盒（GADA、GADA-IgG1、GADA-IgG2a、GADA-IgG2b、IL-4、IFN-γ、TGF-β1，上海通蔚生物科技有限公司）；流 式 抗 體（FITC-CD4、PE-CD25、PE-Cy7-RoRγt、Percp-Foxp3、APC-GATA3、PE-T-bet，美 國Biolegend公司）；破膜固定劑（美國BD公司）；紅細胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

5D-1型血糖儀（臺灣博仕瓏公司）；Spark多功能微孔板檢測儀（瑞士Tecan公司）；流式細胞儀AccuriTM C6 FCM（美國BD公司）；Zetasizer Nano粒度電位儀（馬爾文儀器公司）。

1.3 菌 種

誘導型表達菌株E.coliBL21-pET28a：CTBGADIII，具有卡那霉素抗性，本實驗室保存。

1.4 動 物

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，4~5周齡，購自浙江省醫(yī)學科學院，合格證號：20200610Abzz0118000 762。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方法

2.1 融合蛋白CTB-GADIII的純化及Ca-Alg-GADIII的制備

GADIII融合蛋白的純化［8］及海藻酸鈣納米粒的制備［12］分別參考相關(guān)文獻進行。

2.2 T1D小鼠模型的建立及動物免疫

4~5周齡的C57BL/6小鼠適應1周后，禁食14 h，按50 mg/kg的劑量腹腔注射STZ 0.1 mL，每天1次，連續(xù)5 d。連續(xù)14 d監(jiān)測血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L為造模成功標準，選取造模成功小鼠，隨機分成4組：模型組、空載體對照組（Vehicle組），融合蛋白CTB-GADIII低劑量組（20μg），融合蛋白CTB-GADIII高劑量組（100μg），一周給藥1次，共5次。

2.3 血糖、體重、糖耐量檢測

自造模起使用血糖儀動態(tài)監(jiān)測各只小鼠的尾靜脈血糖水平，同時記錄相應時間點的各只小鼠的準確體重。

給藥結(jié)束后，各組選取5~6只小鼠用于葡萄糖耐量試驗。小鼠禁食過夜，期間自由飲水。次日測定小鼠基礎血糖，之后立即灌胃新鮮配制的葡萄糖生理鹽水溶液，按照每20 g體重灌胃40 mg葡萄糖的量，分別經(jīng)口給予葡萄糖，0，15，30，60，90，120 min測定小鼠尾靜脈血糖，觀察血糖變化趨勢。

2.4 胰腺病理切片的制作及免疫組化分析

給藥結(jié)束后，每組分別選取3只小鼠，無菌條件下取胰腺組織，于組織固定液中固定24 h。胰腺切片制作、HE染色及免疫組化均由中國藥科大學病理與PDX藥效評價平臺完成。

選取3~4張小鼠胰腺切片進行HE染色，對整個切片進行全視野掃描，記錄整個切片中胰島數(shù)目及其病理情況。

小鼠胰腺切片用胰島素抗體染色，檢測胰島素分泌情況。將制備好的不同組別小鼠胰腺切片（每組3只小鼠，每只3~4張切片）進行全視野掃描，每張切片隨機選擇截取5個視野，通過Image Pro Plus圈出各個視野圖片中胰島素陽性染色區(qū)域，以正常組對應像素點為對照，計算出各組胰島素陽性面積。

2.5 血清中相關(guān)自身抗體及細胞因子的檢測

每兩周對小鼠進行一次眼眶取血，于4 000 r/min條件下離心5 min取上清液，所得血清于-80℃條件下冷凍保存。具體實驗步驟按照試劑盒說明書要求進行。

2.6 流式細胞術(shù)檢測T1D小鼠外周免疫器官CD4+T細胞

給藥結(jié)束后，每組分別取3只小鼠處死，無菌條件下取出小鼠脾臟，腸系膜淋巴結(jié)（MLN）和胰腺淋巴結(jié)（PLN）浸泡于含胎牛血清（FBS）的緩沖液（PBS+1% FBS）的平皿中，于200目篩網(wǎng)上研磨，收集細胞懸液，加入總體積1/3的紅細胞裂解液裂解紅細胞。離心后加入含F(xiàn)BS的緩沖液洗滌并計數(shù)，調(diào)整各管細胞濃度，并進行表面染色，相應抗體：CD4-FITC（0.5μL）和CD25-PE（0.5μL），4℃下避光孵育40 min。用含F(xiàn)BS的緩沖液清洗后加入破膜液，4℃避光孵育40 min。進行核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子特異性染色，相應抗體：Foxp3-APC/T-bet-PE（0.5μL）和RoRγt-APC/GATA3-APC（1μL）。4℃下避光孵育30 min。加入含F(xiàn)BS的緩沖液，過200目篩網(wǎng)，轉(zhuǎn)移至流式管后使用流式細胞儀檢測，實驗數(shù)據(jù)采用Flowjo軟件進行分析。

2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s,表示。如無特殊說明所有顯著性均采用獨立樣本t檢驗分析組間差異，P<0.05表示組間差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 融合蛋白CTB-GADIII的純化及Ca-Alg-GADIII的制備

通過對工程菌E.coliBL21-pET28a：CTB-GADIII的培養(yǎng)、乳糖誘導及使用陽離子交換樹脂，誘導表達并純化了融合蛋白CTB-GADIII。如圖1所示，12%SDS-PAGE電泳顯示無明顯其他雜蛋白條帶，使用Image J圖像處理軟件計算目的蛋白條帶灰度與泳道總蛋白灰度比值，分析可得蛋白純度約為96%。非還原條件下可以看到復性后的凍干蛋白溶液在約35、50 kD處有條帶，由于CTB易形成五聚體結(jié)構(gòu)，目的蛋白主要為非共價結(jié)合形成的多聚體，電泳過程中容易被SDS解離成單一亞基，所以在單體相對分子質(zhì)量17 kD處條帶更濃。

Figure 1 Renaturation of fusion protein CTB-GADIII（cholera toxin subunit B-glutamic acid decarboxylase）

通過溶劑擴散法，成功制備了Ca-Alg-GADIII。經(jīng)檢測，Ca-Alg-GADIII的Zeta電位為-67 mV，說明融合蛋白CTB-GADIII已經(jīng)被成功包被形成納米制劑。Ca-Alg-GADIII的粒徑約為277 nm，符合納米粒的粒徑范圍。

3.2 T1D小鼠血糖、體重監(jiān)測及糖耐量測定

給藥結(jié)束后，對不同組別小鼠進行血糖檢測，如圖2所示：給藥組小鼠血糖有明顯改善（圖2-A），部分小鼠血糖恢復正常。同時，通過比較給藥前后不同組別小鼠體重（圖2-B左側(cè)），發(fā)現(xiàn)每組小鼠體重都有不同程度的增長，但高劑量疫苗組小鼠的體重的增長率明顯大于模型組及空載體對照組（圖2-B右側(cè)，P<0.01）。結(jié)果表明：口服疫苗有助于改善T1D小鼠的血糖，同時高劑量疫苗免疫有利于小鼠體重的增加。

給藥結(jié)束后，通過OGTT檢測T1D小鼠的葡萄糖代謝能力。結(jié)果如圖2-C所示，各組小鼠血糖都呈現(xiàn)先升后降的趨勢。通過計算曲線下面積（AUC）發(fā)現(xiàn)，高劑量疫苗組小鼠的AUC與空載體對照組（P<0.05）和模型組（P<0.01）存在顯著差異，說明高劑量疫苗免疫可以明顯提高T1D小鼠葡萄糖耐量。

Figure 2 Ca-Alg-GADIII play a therapeutic effect on T1D mice(±s,,n=4-8)

3.3 T1D小鼠胰腺HE染色及免疫組化

HE染色結(jié)果及免疫組化結(jié)果如圖3-A，B所示，免疫結(jié)束后，正常組小鼠胰島多為圓形和橢圓形，胰島面積較大，界限清楚；空載體對照組小鼠胰島面積明顯縮小，形態(tài)不規(guī)則，分布稀疏。疫苗組小鼠胰腺組織相較于空載體對照組病理情況有所改善。

通過對切片的觀察，發(fā)現(xiàn)給藥與否，不同組別小鼠胰島個數(shù)及面積存在明顯差異，因此按“2.4”項下方法將圖像數(shù)據(jù)化。結(jié)果如圖3-C所示，免疫結(jié)束后，高劑量疫苗組小鼠的胰島個數(shù)相較于低劑量疫苗組略高，二者顯著優(yōu)于空載體對照組（P<0.05），而空載體對照組小鼠胰島個數(shù)明顯小于正常組（P<0.001）。胰島素免疫組化分析結(jié)果表明（圖3-D）：疫苗免疫后小鼠胰腺中胰島素陽性面積較空載體對照組明顯升高（P<0.05）。結(jié)果表明：Ca-Alg-GADIII可以降低發(fā)病過程中的胰腺損傷，促進胰島素分泌，保護T1D小鼠殘存胰島的功能。

3.4 T1D小鼠血清相關(guān)抗體及細胞因子的檢測

血清中T1D相關(guān)自身抗體檢測結(jié)果如圖4所示：與空載體對照組和低劑量疫苗組相比，高劑量疫苗組小鼠血清中GADA含量明顯降低（P<0.05），說明Ca-Alg-GADIII能夠誘發(fā)T1D小鼠重建特異性的體液免疫耐受（圖4-A）。進一步對GADA的抗體分型進行分析，相比于空載體對照組和低劑量疫苗組，高劑量疫苗組小鼠血清中GADAIgG1的含量明顯下降（圖4-B），且與空載體對照組相比，GADA-IgG2a的含量顯著降低（圖4-C，P<0.01）。3組小鼠血清中GADA-IgG2b（圖4-D）含量均無差異。臨床實驗中常用IgG1/IgG2a的變化來判斷疫苗誘導免疫應答的類型，如圖4-E所示，給藥組小鼠血清中IgG1/IgG2a的比值均顯著提高（P<0.05）。此外，本研究檢測了血清中抗胰島素抗體，考察免疫后是否發(fā)生了擴展耐受。如圖4-F所示：與空載體對照組相比，高劑量疫苗組抗胰島素抗體明顯下降（P<0.05），低劑量疫苗組也有所下降。

Figure 3 Ca-Alg-GADIII can sustain islet function of T1D mice(±s,,n=3-6)

Figure 4 Ca-Alg-GADIII modulate the serum level of autoantibodies in T1D mice(±s,,n=4-6)

小鼠血清中相關(guān)細胞因子的含量如圖5所示：相較于空載體對照組，疫苗免疫組IL-4的含量未出現(xiàn)顯著變化，高劑量疫苗組小鼠血清中IFN-γ的含量明顯下降（P<0.05），而TGF-β1（主要由Treg細胞產(chǎn)生）明顯上升（P<0.05）。

Figure 5 Ca-Alg-GADIII modulate the serum cytokine content of T1D mice(±s,,n=5-6)

3.5 流式檢測T1D小鼠MLN、PLN免疫平衡

Figure 6 Ca-Alg-GADIII improves immunomodulatory balance of Th1 and Th2 in the mesenteric lymph node(MLN)of T1D mice(±s,,n=3)

在免疫耐受誘導的實驗中，Th1/Th2，Th17/Treg被視為反應機體免疫與炎癥狀態(tài)變化的重要指標。本研究利用流式細胞術(shù)對3組小鼠MLN、PLN中Th細胞的幾種亞型比例進行了分析，實驗結(jié)果如圖6和圖7所示：5次免疫后，相較于空載體對照組，高劑量疫苗免疫小鼠MLN中促炎性Th1細胞及Th1/Th2的比例明顯降低（P<0.05）。PLN中呈現(xiàn)相似的結(jié)果，相較于空載體對照組和低劑量蛋白組，高劑量疫苗組小鼠的促炎性Th1細胞比例（圖7-C，P<0.05）及Th1/Th2的比例（圖7-E，P<0.05）也明顯降低，Th2細胞沒有明顯變化。不過各組小鼠MLN和PLN中Th17/Treg數(shù)值差別不大（結(jié)果未顯示）。實驗結(jié)果表明：Ca-Alg-GADIII口服疫苗主要是通過抑制Th1型細胞分化、調(diào)控細胞免疫平衡介導免疫保護作用。

Figure 7 Ca-Alg-GADIII improves immunomodulatory balance of Th1 and Th2 in the pancreatic lymph node(PLN)of T1D mice(±s,,n=3)

4 討論

疫苗免疫結(jié)果顯示Ca-Alg-GADIII能緩解T1D小鼠的疾病進程，能改善胰腺組織的病理情況，保護胰島β細胞的功能，具有一定的治療作用。

正常個體中，Th1、Th2型細胞處于相對平衡狀態(tài)，但T1D個體中，內(nèi)源性的Th1型細胞因子占據(jù)主導地位［13-14］，導致大量自身反應性T淋巴細胞浸潤胰島破壞β細胞。其中Th1與Th17可產(chǎn)生多種炎性細胞因子，也是T1D的刺激因素［15-16］；而Th2細胞可抑制Th1分化［17］，Treg細胞與Th17相互拮抗，也可抑制自身反應性T細胞對胰島的攻擊［18］。它們之間的平衡是維持機體炎癥與抗炎以及免疫平衡的重要因素［19］。Ca-Alg-GADIII疫苗免疫后小鼠體內(nèi)自免疫攻擊相關(guān)的Th1被抑制，Th1/Th2的比例降低，同時相關(guān)的自身抗體水平下降，顯示口服疫苗能調(diào)節(jié)T1D小鼠體內(nèi)的細胞及體液免疫平衡，從而緩解并逆轉(zhuǎn)了胰島炎癥及胰島β細胞的損傷。

雖然疫苗的劑量和免疫方案還有待優(yōu)化，但本研究證明了以T1D自身抗原為基礎制備的疫苗可以通過腸道黏膜免疫的方式發(fā)揮作用，同時也驗證了海藻酸鈣作為一種安全有效的口服疫苗載體，克服了蛋白藥物在胃腸道不穩(wěn)定的缺點，可用于蛋白疫苗的腸黏膜免疫。