徐舒怡，李雅賢，胡 海，張 莉，邊延林，朱建偉，吳明媛*

（1上海交通大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞工程及抗體藥物教育部工程研究中心，上海 200240；2上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心，上海 200240）

納米抗體（nanobody，Nb），即重鏈單域抗體（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），是在駱駝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種納米尺寸的天然抗體，相對(duì)分子質(zhì)量約為15 kD，是常規(guī)抗體的十分之一［1］。納米抗體僅含有3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），其中CDR3區(qū)域呈明顯的長(zhǎng)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有利于與隱蔽的抗原表位結(jié)合［2］。納米抗體的尺寸較小，可以穿過(guò)機(jī)體組織生理屏障或者狹小區(qū)域到達(dá)靶器官；具有良好的熱穩(wěn)定性和水溶性，可在大腸埃希菌、酵母等表達(dá)系統(tǒng)中大規(guī)模生產(chǎn)［3］；同時(shí)，納米抗體制備簡(jiǎn)單，可用于構(gòu)建多種分子結(jié)構(gòu)，包括具有雙特異性或雙功能的抗體，能夠避免重鏈和輕鏈的錯(cuò)配，從而簡(jiǎn)化分離、純化步驟以提高質(zhì)量和產(chǎn)率［4］，已成為抗體藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。2018年，第1個(gè)納米抗體藥物Caplacizumab獲歐洲藥物管理局批準(zhǔn)上市，由針對(duì)血管性血友病因子的VHH二聚體組成，用于治療成人獲得性血栓性血小板減少性紫癜（aTTP）［5］。

過(guò)去數(shù)十年中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑改寫了腫瘤治療的歷史，將晚期腫瘤的藥物治療向前推進(jìn)了一大步。免疫檢查點(diǎn)療法的靶點(diǎn)主要包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）、程序性死亡蛋白-1及其配體（PD-1/PD-L1）［6］。PD-1由活化T細(xì)胞表達(dá)，而PD-L1常在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。腫瘤細(xì)胞會(huì)利用其表面過(guò)表達(dá)的PD-L1，抑制T細(xì)胞的活化，引起T細(xì)胞凋亡，從而躲避免疫監(jiān)視和免疫攻擊［7］。拮抗負(fù)調(diào)控信號(hào)PD-1/PD-L1，有利于T細(xì)胞持續(xù)活化，殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［8-9］。目前，抗PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)療法的響應(yīng)率仍然較低，其中腫瘤微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)不足是限制臨床療效的關(guān)鍵因素［10］，腫瘤周圍的免疫抑制性微環(huán)境也阻止了活化的淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤部位［11］。有證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境中的趨化因子CXCL12能夠支持腫瘤基質(zhì)的生長(zhǎng)，募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）等，形成物理屏障，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受藥物和免疫系統(tǒng)的殺傷［12］。其受體CXCR4在多種腫瘤中高表達(dá)，如胰腺癌、乳腺癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌等。CXCR4/CXCL12信號(hào)軸在腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥中起到關(guān)鍵作用［13］，而CXCR4拮抗劑以多種作用模式影響腫瘤微環(huán)境，包括誘導(dǎo)免疫細(xì)胞遷移、增加效應(yīng)T細(xì)胞的浸潤(rùn)、減少腫瘤微環(huán)境中免疫抑制細(xì)胞，提高了胰腺癌等惡性腫瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑和化療藥物的敏感性［14-15］。因此，拮抗CXCR4/CXCL12和PD-1/PD-L1的藥物組合能夠逆轉(zhuǎn)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)了免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果［16］。

本研究針對(duì)PD-L1和CXCR4兩個(gè)靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的重組表達(dá)載體，通過(guò)大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)不同的純化策略，來(lái)獲得純度和產(chǎn)量較高的目的蛋白，體外實(shí)驗(yàn)證明具有特異性的雙抗原結(jié)合能力和生物學(xué)活性，為進(jìn)一步研究雙特異性納米抗體的抗腫瘤免疫治療提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 試 劑

Ficoll-Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)GE公司）；重組人白細(xì)胞介素-2（IL-2，上海華新生物高技術(shù)有限公司）；小鼠抗多組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體（美國(guó)Proteintech Group公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的小鼠抗多組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；小鼠抗人PDL1單克隆抗體（北京義翹神州科技有限公司）；重組兔抗人CXCR4單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）；Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗小鼠IgG第二抗體、Alexa Fluor 647標(biāo)記的羊抗兔IgG第二抗體、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG第二抗體（上海翊圣生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）殺傷活性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Tanon-5200Multi凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；Cytoflex型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；蛋白分離純化系統(tǒng)?KTA Start、HisTrap FF親和色譜柱（美國(guó)GE公司）。

1.3 菌株和細(xì)胞株

感受態(tài)大腸埃希菌BL21（DE3）菌株（上海唯地生物技術(shù)有限公司）；人白血病T淋巴細(xì)胞株Jurkat、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251-MG、人轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；健康志愿者外周血由上海長(zhǎng)海醫(yī)院輸血科提供。

2 方法

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

anti-PD-L1和anti-CXCR4的納米抗體基因序列均由文獻(xiàn)獲得［17-18］，兩部分由linker（3個(gè)G4S短肽）連接起來(lái)，C端加入多組氨酸標(biāo)簽（6×His標(biāo)簽），組裝為anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體（簡(jiǎn)稱為BsNb PX4）的基因序列。將該基因序列轉(zhuǎn)入到pET-22b（+）載體中，酶切位點(diǎn)為NcoⅠ與EcoRⅠ，構(gòu)建BsNb PX4的重組質(zhì)粒，以上均由南京金斯瑞公司合成。

2.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-BsNb PX4轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），篩選陽(yáng)性克隆并抽提質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)。接種于含氨芐青霉素（Amp）的LB培養(yǎng)基5 mL中，37℃，220 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜后全部轉(zhuǎn)接至含Amp的TB培養(yǎng)基500 mL，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液A600達(dá)到0.6~0.8，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，25℃誘導(dǎo)18 h后收集菌液。

2.3 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的純化

離心收集菌液500 mL，向菌體沉淀加入破菌緩沖液（PBS）25 mL，冰浴超聲重懸，高壓勻質(zhì)儀多次循環(huán)充分破碎菌體，即機(jī)械裂解法破菌；或向菌體沉淀加入高濃度蔗糖-三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES）溶液25 mL，冰上充分振搖1 h后，再加入原濃度1/4的蔗糖-TES溶液50 mL，繼續(xù)冰浴振搖45 min，即低溫滲透壓休克法提取周質(zhì)空間蛋白。菌體裂解后的樣品12 000 r/min，4℃，離心30 min，收集上清液。菌體裂解后上清液通過(guò)親和色譜純化，結(jié)合緩沖液（pH 7.4）平衡HisTrap FF柱，上樣結(jié)束后用洗脫緩沖液進(jìn)行分部梯度洗脫，收集洗脫峰。菌體裂解方式、裂解緩沖液、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液如表1所示。

Table 1 Cell disruption techniques and buffers of 3 purification methods

考馬斯亮藍(lán)R-250染色和Western blot對(duì)洗脫峰樣品進(jìn)行鑒定。將目的蛋白在4℃透析24 h，去除咪唑；使用超濾離心管，4 000 r/min，4℃，離心30 min，濃縮蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

2.4 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的抗原結(jié)合能力分析

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮細(xì)胞Jurkat和貼壁細(xì)胞U251-MG、AsPC-1，用含2%FBS的PBS溶液重懸洗滌2次，1 200 r/min離心5 min。吸棄上清液，加入含2%FBS的PBS溶液200μL重懸細(xì)胞，分別在細(xì)胞樣品中加入BsNb PX4 1μg作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠抗多組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體作為熒光二抗，分別選用小鼠抗人PD-L1單克隆抗體與重組兔抗人CXCR4單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照的一抗，Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗小鼠IgG第二抗體、Alexa Fluor 647標(biāo)記的羊抗兔IgG第二抗體作為對(duì)應(yīng)的熒光二抗。4℃避光孵育30 min后，用PBST洗滌2次，重懸于2%FBS的PBS溶液，終體積為100μL。流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞PD-L1和CXCR4的抗原表達(dá)情況，分析BsNb PX4的抗原結(jié)合能力。

2.5 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的生物活性檢測(cè)

2.5.1 人外周血單核細(xì)胞（PBMC）的分離 取新鮮健康志愿者外周血，與DPBS按1∶7比例稀釋混勻后，加入到Ficoll-Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液，1 200 r/min，20℃梯度離心30 min，吸取中間白霧層，分別用DPBS和含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌兩次，調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升1×106個(gè)細(xì)胞備用。

2.5.2 LDH法檢測(cè)PBMC對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的胰腺癌細(xì)胞AsPC-1用0.25%的胰酶消化、計(jì)數(shù)，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升3×104個(gè)細(xì)胞。將AsPC-1細(xì)胞均勻鋪于96孔板，每孔100μL，置于37℃，貼壁培養(yǎng)12 h。取新鮮分離的人PBMC用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度，鋪于96孔板，每孔50μL，使效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為10∶1或15∶1，共培養(yǎng)24 h，然后加入IL-2（工作濃度100 IU/mL），置于37℃培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。BsNb PX4分別用含2% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋，每孔加入50μL，終濃度為0.5μmol/L，對(duì)照組加入等體積含2% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h。檢測(cè)前，在靶細(xì)胞最大釋放組中添加10%Triton X-100裂解液，每孔20μL，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育20 min。水平離心后，轉(zhuǎn)移上清液50μL至全新的96孔板中，每孔加入LDH基質(zhì)液50μL，室溫孵育20 min，每孔加入終止液50μL終止反應(yīng)并記錄A490。

殺傷率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸收度-效應(yīng)細(xì)胞釋放組吸收度-靶細(xì)胞釋放組吸收度）/（靶細(xì)胞最大釋放組吸收度-靶細(xì)胞釋放組吸收度）×100。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間比較采用Tukey檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s,表示，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的構(gòu)建和表達(dá)

如圖1-A所示，選取pET-22b載體，構(gòu)建anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的重組質(zhì)粒，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，序列正確。anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體基因序列全長(zhǎng)1 263 bp，編碼421個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為43.8 kD。

將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-BsNb PX4轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），TB培養(yǎng)基用于菌體擴(kuò)增和蛋白表達(dá)。當(dāng)菌液A600為0.6~0.8時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。將誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h的重組大腸埃希菌破碎處理，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)，如圖1-A和圖1-B所示，誘導(dǎo)后的全菌液在44 kD附近出現(xiàn)條帶，符合預(yù)期產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量大小，并且能與抗多組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體特異性地結(jié)合，說(shuō)明anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體能夠在大腸埃希菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。

Figure 1 Construction and expression of recombinant protein

3.2 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的親和純化

如圖2-A所示，采用方法（1）純化后的色譜圖譜共出現(xiàn)6個(gè)峰，經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)前4個(gè)峰所得到的樣品雜蛋白較多，但在50%和100%洗脫緩沖液（圖中以50% B和100% B表示）中，得到相對(duì)分子質(zhì)量約44 kD的目的條帶，純度較高，基本無(wú)雜質(zhì)被洗脫。如圖2-B所示，含目的蛋白的上清液經(jīng)方法（2）進(jìn)行親和色譜，在用20%洗脫緩沖液洗脫時(shí)，BsNb PX4被大量洗脫且洗脫峰獨(dú)立，雜蛋白含量較少。如圖2-C所示，方法（3）只出現(xiàn)一個(gè)洗脫峰，但與方法（2）相比，20%洗脫緩沖液的洗脫峰顯示有多個(gè)雜帶。因此，收集方法（1）的50%和100%洗脫緩沖液的洗脫峰，分別合并方法（2）和方法（3）的20%洗脫緩沖液的洗脫峰各管樣品，透析去除咪唑，超濾濃縮。

Figure 2 Affinity purification process of BsNb PX4

SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)透析后得到的目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量和特異性，如圖3所示，在44 kD出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的雙特異性納米抗體相對(duì)分子質(zhì)量相符。但是在30 kD左右存在一條雜帶，推測(cè)其為C端帶有多組氨酸標(biāo)簽的anti-CXCR4-VHH（二價(jià)納米抗體），可能是雙特異性納米抗體表達(dá)分泌過(guò)程中由宿主蛋白酶降解得到的產(chǎn)物。

用BCA法對(duì)3種目的蛋白進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表2所示，方法（1）獲得的BsNb PX4產(chǎn)量約1.12 mg/L，凝膠成像系統(tǒng)掃描顯示目的蛋白純度在97%以上；方法（2）獲得的BsNb PX4產(chǎn)量約1.34 mg/L，純度接近90%；方法（3）獲得的BsNb PX4產(chǎn)量約7.0 mg/L，但樣品中仍含有較多的雜蛋白。因此，后續(xù)選擇方法（1）制備得到純度最高的BsNb PX4進(jìn)行抗原結(jié)合和體外生物學(xué)活性檢測(cè)。

3.3 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的抗原結(jié)合能力

流式分析雙特異性納米抗體結(jié)合抗原的能力，如圖4所示，U251-MG細(xì)胞株針對(duì)PD-L1抗原顯示出明顯的熒光信號(hào)偏移，呈高陽(yáng)性表達(dá)，而兔抗人CXCR4 IgG抗體和羊抗兔IgG-FITC熒光抗體組合相較于單染羊抗兔IgG-FITC熒光抗體的陰性對(duì)照并無(wú)變化；Jurkat細(xì)胞株為CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞株，在靜息條件下其細(xì)胞膜表面PD-L1抗原無(wú)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［19］。

Figure 3 SDS-PAGE and Western blot detection of the dialyzed main elution peak sample

Table 2 Yield and purity of products obtained by 3 purification methods

由于雙特異性納米抗體帶有6×His標(biāo)簽，可用FITC偶聯(lián)的anti-6×His標(biāo)簽抗體作為熒光標(biāo)記。如圖5所示，BsNb PX4在U251-MG細(xì)胞上（PD-L1+、CXCR4-）均能夠檢測(cè)到與PD-L1分子結(jié)合后產(chǎn)生的熒光信號(hào)偏移；在Jurkat細(xì)胞上（PDL1-、CXCR4+）也具有與CXCR4抗原的結(jié)合能力，證實(shí)了純化得到的雙特異性納米抗體對(duì)兩個(gè)靶點(diǎn)均具有結(jié)合活性。此外，BsNb PX4與同時(shí)表達(dá)PD-L1和CXCR4抗原的AsPC-1細(xì)胞也有較為明顯的結(jié)合。

Figure 4 Detection of PD-L1 or CXCR4 expression in tumor cell line by flow cytometry

3.4 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的抗腫瘤活性

在anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體0.5μmol/L條件下，PBMC與靶細(xì)胞AsPC-1繼續(xù)孵育48 h后進(jìn)行LDH釋放檢測(cè)，分析PBMC對(duì)AsPC-1細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，BsNb PX4單獨(dú)作用于共孵育體系，PBMC的殺傷活性有所增強(qiáng)，推測(cè)可能是雙特異性納米抗體識(shí)別了PBMC中T細(xì)胞表面的CXCR4，同時(shí)與AsPC-1細(xì)胞上的PD-L1結(jié)合，可以將效應(yīng)T細(xì)胞募集到腫瘤細(xì)胞周圍，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性［20］。另一方面，當(dāng)PBMC與AsPC-1細(xì)胞數(shù)之比為10∶1和15∶1時(shí)，BsNb PX4聯(lián)合IL-2能夠顯著提高PBMC對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，與IL-2組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有協(xié)同效應(yīng)。這些結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)論是相符的，IL-2可刺激CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞等擴(kuò)增，同時(shí)細(xì)胞表面的PD-L1表達(dá)增高，證明其與PD-L1抑制劑具有潛在協(xié)同作用機(jī)制［21］；而通過(guò)抑制CXCR4可以導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞遷移到癌細(xì)胞富集的區(qū)域，然后阻斷PD-1/PD-L1通路能夠重新激活對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用，以上表明PD-1/PD-L1和CXCR4/CXCL12軸的聯(lián)合阻斷有望成為胰腺癌的新型治療策略［22］。

Figure 5 FACS analysis of BsNb PX4 binding to tumor cells

Figure 6 In vitro cytotoxicity of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)with IL-2 and BsNb PX4 treatment using lactate dehydrogenase(LDH)released assay(±s,,n=3)

4 討論

在本研究中設(shè)計(jì)的anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體基因上游含有編碼細(xì)菌pelB蛋白的信號(hào)肽序列，可引導(dǎo)融合蛋白分泌至大腸埃希菌的周質(zhì)空間中，并以可溶形式存在；通過(guò)改變破菌提取蛋白的方法，調(diào)整純化緩沖溶液中鹽離子濃度和咪唑濃度，使用3種不同方法對(duì)BsNb PX4進(jìn)行純化，以純度為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定了合適的納米抗體制備方案。治療性抗體的工藝相關(guān)雜質(zhì)（宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)等）不僅影響藥物的穩(wěn)定性和活性，而且還可能導(dǎo)致有害的免疫反應(yīng)［23］。因此，抗體的純化條件必須優(yōu)化，例如采用分部或者線性梯度洗脫、確定結(jié)合和洗脫過(guò)程中合適的鹽離子濃度和pH。在用親和色譜純化His標(biāo)記的蛋白質(zhì)時(shí)，通常將咪唑添加到結(jié)合緩沖液中以調(diào)節(jié)非特異性結(jié)合。但是，在分析親和色譜圖和洗脫峰的SDSPAGE電泳結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)方法（1）將結(jié)合緩沖液更換成不含咪唑的低濃度NaCl溶液，同時(shí)在洗脫緩沖液中增加咪唑的含量并提高溶液的pH，通過(guò)分部梯度洗脫可以將目的蛋白和雜質(zhì)幾乎完全分開，BsNb PX4的最終純度達(dá)到97%以上。對(duì)比同樣使用機(jī)械裂解法提取蛋白的方法（3），降低結(jié)合緩沖液中的咪唑和鹽離子濃度可能提高了目的蛋白的掛柱率，而洗脫液的pH和咪唑濃度影響了目的蛋白的洗脫效果，導(dǎo)致不同方法獲得的BsNb PX4純度有明顯區(qū)別。方法（2）中高濃度蔗糖-TES溶液介導(dǎo)的低溫滲透壓休克法提取蛋白，雖然出峰過(guò)程簡(jiǎn)單，產(chǎn)量相近，但目的蛋白的純度下降至87%，后續(xù)仍需增加離子交換或分子篩色譜處理，過(guò)程相對(duì)繁瑣。

因此，方法（1）得到的anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體純度滿足了臨床前的研發(fā)要求，流式檢測(cè)證明其與細(xì)胞表面的兩個(gè)靶抗原特異性結(jié)合，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)的雙特異性納米抗體能夠正確折疊形成抗原結(jié)合域并保持分子完整性。同時(shí)，生物學(xué)活性結(jié)果也表明洗脫條件溫和，不會(huì)導(dǎo)致目的蛋白失活。該方案的設(shè)計(jì)是一步純化法，具有操作簡(jiǎn)單，成本低等優(yōu)點(diǎn)，也適用于含His標(biāo)簽等多種類型的蛋白質(zhì)純化，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

當(dāng)然，在納米抗體的純化過(guò)程中也存在諸多問(wèn)題，如產(chǎn)量和回收率還相對(duì)較低。如何在保證高純度的前提下實(shí)現(xiàn)抗體產(chǎn)量的最大化，一直是生物制藥領(lǐng)域的難題，需要進(jìn)一步摸索和優(yōu)化工藝。此外，雙特異性納米抗體增強(qiáng)PBMC對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)的機(jī)制也亟待深入探究和驗(yàn)證。