張 艷，江振洲*，張陸勇，2**

（1中國(guó)藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院新藥篩選中心，南京 210009；2廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣州 510006）

中藥補(bǔ)骨脂是豆科植物補(bǔ)骨脂的干燥成熟果實(shí)，具有抗腫瘤（如肝癌、乳腺癌、胃癌等）、治療骨質(zhì)疏松和銀屑病等多種功效［1］，主要含有香豆素、單萜酚、黃酮、苯并呋喃類等活性成分［2］，補(bǔ)骨脂素（psoralen，PSO）屬于其中的呋喃香豆素類化合物［3］。香豆素類化合物進(jìn)入機(jī)體后，分布于心、肝、肺、脾等組織中，然后主要在肝中代謝［4］。

由于環(huán)境因素與人們生活方式的改變，肝病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，其中化學(xué)性肝損傷是常見的病因［5-6］。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘發(fā)的急性肝損傷是經(jīng)典的化學(xué)性肝損傷模型，其病理進(jìn)程與某些人類肝臟疾病類似，故是保肝藥物藥效評(píng)價(jià)的常用動(dòng)物模型［7］。

CYP2E1是細(xì)胞色素P450的重要亞型，占肝中總CYP450含量的5%～7%，是肝組織中氯代烴類化合物的主要代謝酶，可以代謝產(chǎn)生有毒或反應(yīng)性中間體，與多種肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［8］。

目前關(guān)于補(bǔ)骨脂素治療肝臟疾病的報(bào)道主要集中在改善肝細(xì)胞脂肪變性、抗肝癌以及抗肝纖維化作用方面［9-12］，而對(duì)于急性肝損傷藥效作用的研究很少。本研究旨在探究補(bǔ)骨脂素對(duì)于CCl4致急性肝損傷的改善作用以及可能機(jī)制，以期為補(bǔ)骨脂素及補(bǔ)骨脂藥材的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

補(bǔ)骨脂素（批號(hào)JZ18071201，純度大于98%，南京景竹生物科技有限公司）；烯丙基化硫（diallyl sulfide，DAS，美國(guó)Sigma公司）；CCl4（AR級(jí)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；總RNA提取試劑，HiScript?Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix DNA擴(kuò)增試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；GAPDH抗體（美國(guó)Proteintech公司）；CYP2E1抗體（英國(guó)Abcam公司）。ALT、AST血生化試劑盒（南京威特曼生物科技有限公司）。所用引物由上海英濰捷基公司合成。

1.2 儀 器

BT25S分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Legend Micro 21R低溫離心機(jī)，Varioskan Lux多功能微孔板讀數(shù)儀，Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀，Applied Biosystems StepOneTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司）；TL系列中高通量組織細(xì)胞研磨破碎儀（北京鼎昊源科技有限公司）；D1100-230V恒溫金屬?。绹?guó)Labnet公司）；Power-Pac?HC電泳儀電源，Gel Doc XR+凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BX53生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動(dòng) 物

SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體重18~22 g，購(gòu)自上海靈暢生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0003。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法

2.1 造模及給藥方法

48只雌性C57BL/6J小鼠分為6組，每組8只，分別為溶劑對(duì)照組（Control）、模型組（Model）、陽(yáng)性藥組（DAS）、補(bǔ)骨脂素低、中、高劑量組（PSO-L、PSO-M、PSO-H）。補(bǔ)骨脂素給藥組每天灌胃給予PSO 25、50、100 mg/kg（0.5% CMC-Na配制的混懸液），陽(yáng)性藥組每天灌胃給予DAS 200 mg/kg，溶劑對(duì)照組和模型組灌胃給予相應(yīng)體積的0.5%CMCNa，連續(xù)4 d。模型組、給藥組和陽(yáng)性藥組在第4天給藥后1 h，單次腹腔注射給予CCl4100μL/kg（橄欖油配制，體積分?jǐn)?shù)為2%），溶劑對(duì)照組則腹腔注射給予同樣體積的橄欖油。第5天給藥結(jié)束后2 h眼球采血，頸椎脫臼處死小鼠，分離肝臟。

另取12只C57BL/6J小鼠，6只為對(duì)照組，連續(xù)灌胃0.5%CMC-Na 5 d，6只為單給補(bǔ)骨脂素組，即單獨(dú)灌胃PSO 100 mg/kg 5 d，檢測(cè)對(duì)CYP2E1蛋白表達(dá)量的影響。

2.2 肝臟指數(shù)

小鼠肝臟用生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)，即肝臟占體重的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

將小鼠血樣3 500 r/min離心10 min，移液器吸取上層血清至1.5 mL EP管中，按血生化試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清ALT、AST水平。

2.4 肝臟病理學(xué)檢測(cè)

取肝臟左側(cè)大葉中間部分，在10%中性甲醛中固定48 h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅（HE）染色，最后在BX53顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)變化。

2.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

稱取肝組織50 mg，加入RIPA裂解液提取肝總蛋白，使用BCA法定蛋白，金屬浴煮蛋白，-20℃保存變性蛋白。取等體積蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，在冰上恒流模式下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，4℃孵育一抗過(guò)夜。第2天用TBST洗膜，孵育二抗1 h，再洗膜，采用化學(xué)發(fā)光法曝光。使用Image J進(jìn)行蛋白條帶的灰度分析。

2.6 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

稱取肝組織30 mg，加Trizol裂解液1 mL提取總RNA。使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度，在逆轉(zhuǎn)錄儀上將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定cDNA樣品中的TNF-α、IL-6和CYP2E1的基因水平。選用GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列如表1所示。

Table 1 Primer sequences for Real-time quantitative PCR assay

2.7 免疫組織化學(xué)染色

將肝組織的石蠟切片進(jìn)行脫蠟，抗原修復(fù)，封閉，4℃一抗孵育過(guò)夜，PBS漂洗，室溫孵育二抗，再PBS漂洗，DAB顯色，蘇木精染色，BX53顯微鏡下觀察CYP2E1蛋白表達(dá)量變化及肝細(xì)胞定位情況。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s,表示。組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化圖使用Image J掃描陽(yáng)性區(qū)域比率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)骨脂素對(duì)CCl4致急性肝損傷模型中小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

體重結(jié)果如圖1所示，各組小鼠在第4天腹腔注射CCl4或者橄欖油后，體重均有所下降，而各組間體重?zé)o明顯差異。從肝臟指數(shù)結(jié)果來(lái)看，模型組和陽(yáng)性藥組的肝臟指數(shù)有所升高，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組相比，補(bǔ)骨脂素給藥組的肝臟指數(shù)則均有明顯上升，并呈一定的劑量相關(guān)性。

Figure 1 Effect of psoralen(PSO)on the body weight(A)and liver index(B)in CCl4-induced acute liver injury mouse model taking diallyl sulfide(DAS)as positive control(±s,,n=8)

3.2 補(bǔ)骨脂素對(duì)CCl4致急性肝損傷模型中小鼠血清生化水平的影響

如圖2血清生化結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，模型組ALT和AST水平顯著升高，補(bǔ)骨脂素給藥后，呈劑量相關(guān)性的降低ALT和AST水平，補(bǔ)骨脂素的中、高劑量組幾乎可以使ALT、AST恢復(fù)到溶劑對(duì)照組水平。

3.3 肝組織病理學(xué)檢測(cè)

肝HE染色結(jié)果如圖3所示，溶劑對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，而模型組可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死，補(bǔ)骨脂素給藥后，低劑量組的肝細(xì)胞仍可見部分病變區(qū)域，而中、高劑量組改善明顯，幾乎無(wú)肝細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但是補(bǔ)骨脂素給藥組均會(huì)出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞增大現(xiàn)象，呈現(xiàn)空泡樣改變。

3.4 Western blot和RT-PCR測(cè)定補(bǔ)骨脂素對(duì)CYP2E1蛋白和基因水平的影響

如圖4-A所示，與溶劑對(duì)照組相比，模型組的CYP2E1表達(dá)下調(diào)，與模型組相比，補(bǔ)骨脂素給藥組的CYP2E1表達(dá)均低于模型組，但是隨著劑量升高，呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，陽(yáng)性藥組的CYP2E1蛋白表達(dá)則無(wú)明顯變化。

如圖4-B所示，與溶劑對(duì)照組相比，正常小鼠單給補(bǔ)骨脂素100 mg/kg可以明顯下調(diào)CYP2E1的蛋白水平。

如圖4-C所示，CYP2E1的PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果基本一致，模型組CYP2E1明顯下調(diào)，補(bǔ)骨脂素給藥后有所上調(diào)。

Figure 2 Effect of psoralen on serum alanine aminotransferase(ALT)(A)and aspartate aminotransferase(AST)(B)levels in CCl4-induced acute liver injury mouse model(±s,,n=8)

Figure 3 Effect of psoralen on liver histopathology of mice in CCl4-induced acute liver injury mouse model(HE staining,×200)

3.5 免疫組化測(cè)定補(bǔ)骨脂素對(duì)CYP2E1蛋白表達(dá)的影響

免疫組化及半定量分析結(jié)果（圖5）顯示，各組CYP2E1蛋白表達(dá)趨勢(shì)與Western blot結(jié)果基本一致，模型組CYP2E1有所下調(diào)，而補(bǔ)骨脂素中、高劑量給藥后可以上調(diào)CYP2E1的表達(dá)。

3.6 補(bǔ)骨脂素對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷模型中炎癥因子基因水平的影響

PCR結(jié)果如圖6所示，與溶劑對(duì)照組相比，模型組炎癥因子表達(dá)明顯上調(diào)，補(bǔ)骨脂素給藥后可以呈劑量相關(guān)性的下調(diào)炎癥因子基因水平。

Figure 4 Effect of psoralen on the protein and gene expression level of CYP2E1(±s,,n=3-8)

Figure 5 Effect of psoralen on expression of CYP2E1 in CCl4-induced acute liver injury mouse model by IHC and semi-quantitative analysis(±s,,n=3)

Figure 6 Effect of psoralen on mRNA levels of TNF-α(A)and IL-6(B)in CCl4-induced acute liver injury mouse model(±s,,n=8)

4 討論

在CCl4致小鼠急性肝損傷模型中，主要是破壞肝細(xì)胞，使細(xì)胞膜通透性改變，細(xì)胞內(nèi)的ALT和AST大量進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中轉(zhuǎn)氨酶水平顯著上升［13］。組織病理學(xué)變化主要是肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝索結(jié)構(gòu)排列紊亂［14］。病理進(jìn)程具有時(shí)間依賴性，最早的組織損傷出現(xiàn)在6 h后，12 h左右可以觀察到明顯的組織損傷，24 h達(dá)到損傷高峰［15-16］，所以本研究選擇CCl4造模24 h后解剖動(dòng)物。在補(bǔ)骨脂素給藥后，25、50、100 mg/kg 3個(gè)劑量均能不同程度地降低轉(zhuǎn)氨酶水平，改善小鼠肝細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，而且中、高劑量組的改善作用明顯。以上結(jié)果表明補(bǔ)骨脂素對(duì)于CCl4致小鼠急性肝損傷具有明顯的改善作用。

CCl4致急性肝損傷模型的發(fā)病機(jī)制主要是CCl4在CYP2E1的代謝下，產(chǎn)生毒性自由基CCl-3和CCl3O-2，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使膜通透性增大，引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使肝細(xì)胞變性、壞死［17-18］。肝臟是補(bǔ)骨脂素給藥后分布最多的器官［19］，也是主要的代謝器官［4］，文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂素對(duì)小鼠肝CYP2E1活性和蛋白水平可產(chǎn)生抑制作用［20］。基于以上研究結(jié)果提示補(bǔ)骨脂素有可能通過(guò)影響CYP2E1發(fā)揮肝保護(hù)作用。

從Western blot和免疫組化結(jié)果來(lái)看，模型組的CYP2E1蛋白表達(dá)下調(diào)，在模型早期，在CCl4的刺激下機(jī)體會(huì)出現(xiàn)自我保護(hù)機(jī)制［15］，即大量CCl4進(jìn)入機(jī)體經(jīng)CYP2E1代謝產(chǎn)生毒性自由基，這些毒性自由基會(huì)負(fù)反饋抑制CYP2E1的表達(dá)。補(bǔ)骨脂素給藥后，小鼠肝細(xì)胞損傷逐漸改善，產(chǎn)生的毒性自由基減少，對(duì)CYP2E1的負(fù)反饋抑制作用減弱，所以隨著補(bǔ)骨脂素劑量增加，CYP2E1的表達(dá)有逐漸上升趨勢(shì)，但是均低于模型組，這可能是因?yàn)檠a(bǔ)骨脂素本身可以抑制CYP2E1的表達(dá)，單給補(bǔ)骨脂素的Western blot結(jié)果也證明，補(bǔ)骨脂素100 mg/kg明顯抑制CYP2E1的蛋白水平。陽(yáng)性藥DAS是CYP2E1的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑［21-22］，主要影響CYP2E1的酶活性，對(duì)CYP2E1蛋白表達(dá)量影響較小，所以與溶劑對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥組的CYP2E1蛋白水平幾乎沒(méi)有變化。上述結(jié)果說(shuō)明，補(bǔ)骨脂素對(duì)于CYP2E1蛋白表達(dá)量的抑制，可能與其發(fā)揮藥效作用的機(jī)制有關(guān)，通過(guò)抑制CYP2E1的表達(dá)，減少CCl4經(jīng)CYP2E1代謝產(chǎn)生毒性自由基，從而拮抗肝損傷。

綜上所述，補(bǔ)骨脂素對(duì)于CCl4致小鼠急性肝損傷具有改善作用，其可能作用機(jī)制之一是抑制CYP2E1的蛋白表達(dá)，從而減輕CCl4誘發(fā)的急性肝損傷。