劉紹博，孫暉，盧盛文，張愛華，王慧，魏文峰，韓金潤，王喜軍

(黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040)

知柏地黃丸作為治療腎陰虛證的經(jīng)典方劑，其獨特的治療效果，備受中醫(yī)界的推崇?，F(xiàn)代藥理研究證明，知柏地黃丸對激素代謝紊亂具有良好的治療作用，可以有效調(diào)控下丘腦-垂體-腎上腺軸等靶腺軸激素代謝紊亂癥[1-3]。同時，在成分研究中，發(fā)現(xiàn)知柏地黃丸的化學成分復雜，含有包括生物堿、皂苷、單萜、黃酮類成分在內(nèi)的多種化學物質(zhì)。在體外檢測到的96種化學成分中，25種來自關(guān)黃柏，22種來自知母，可見知母與關(guān)黃柏的重要性與配伍規(guī)律結(jié)果相一致。但現(xiàn)階段知柏地黃丸的質(zhì)量控制標準并沒有完全表現(xiàn)出上述結(jié)果[4-5]。

根據(jù)《中國藥典》要求，知柏地黃丸的質(zhì)量控制標準為：馬錢素不低于3.6 mg(大蜜丸)；丹皮酚不低于5.0 mg(大蜜丸)。首先，知柏地黃丸是由眾多藥材組成，且化學物質(zhì)繁雜的方劑，兩種化學物質(zhì)的標準不能完全、準確地反映知柏地黃丸的質(zhì)量。其次，根據(jù)文獻結(jié)果以及前期實驗基礎(chǔ)，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)黃柏與知母是知柏地黃丸發(fā)揮療效的重要組成部分，但馬錢素和丹皮酚不是關(guān)黃柏與知母的主要成分，這與知柏地黃丸的配伍規(guī)律相矛盾。

本實驗以中醫(yī)方證代謝組學為研究策略[6-9]，結(jié)合UPLC-MS高通量液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，構(gòu)建了腎陰虛大鼠模型與知柏地黃丸藥物有效性評價體系，通過代謝組學分析確定血液代謝標記物，并在有效狀態(tài)下，尋找知柏地黃丸的血中移行成分，確定知柏地黃丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。最終，根據(jù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究結(jié)果，依據(jù)中藥質(zhì)量標志物的基本原則，確定知柏地黃丸治療腎陰虛證的潛在中藥質(zhì)量標志物。

1 材料

1.1 儀器

AcquityTM UPLC液相色譜儀(Waters 集團公司，美國)；SynaptTM G2-Si質(zhì)譜分析系統(tǒng)(Waters 集團公司，美國)；MassLynx V4.1工作站(Waters 集團公司，美國)；Sorvall ST 16R臺式離心機(美國Thermo Scientific公司)；KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SL-1000XLS型移液器(梅特勒·托利多儀器有限公司,上海)；氮吹儀(美國Organomation公司)；Unique-R20多功能超純水系統(tǒng)(廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司，中國)；Thermo Scientific 995 超低溫冰箱(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 藥品與試劑

知母、熟地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮，7味中藥材購于北京同仁堂哈爾濱總店，關(guān)黃柏購自于世一堂哈爾濱總店。乙腈為色譜級(德國Merck公司)，甲醇為色譜級(美國Fisher公司)，色譜級甲酸購自于天津科密歐化學試劑有限公司，亮氨酸腦啡肽來自美國Sigma公司。

1.3 藥液的制備

取購買的中藥飲片經(jīng)高速多功能粉碎機粉碎后，過120目篩，得到細粉，經(jīng)查知柏地黃丸的成人用量為9 g/次，每日2次，故算得大鼠所需劑量為1.62 g·kg-1·次-1，取知柏地黃丸細粉末，加適量0.5%的CMC-Na溶液溶解，超聲處理約30 min，制成濃度為0.162 g/mL的灌胃溶液。

1.4 實驗動物

清潔級SD大鼠，雄性,6周齡，體質(zhì)量(220±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,動物許可證號(SCXK2015-0001)。室溫飼養(yǎng)，動物自由攝食飲水。

2 方法

2.1 模型分組與復制

實驗采用給予氫化可的松溶液的方式[10]，復制腎陰虛證大鼠模型。取雄性SD大鼠50只，采用隨機數(shù)表法，隨機分成2組,即：空白對照組(C，n=20)，腎陰虛證模型組(M，n=30)，實驗開始前進行7 d的適應性培養(yǎng)。實驗開始后，M組大鼠灌胃給予氫化可的松溶液(50 mg·kg-1·d-1)，共4 d，同時空白對照組每天灌胃給予生理鹽水直到實驗結(jié)束。

2.2 給藥

自第5天起，模型組隨機抽取10只大鼠，成立知柏地黃丸治療組(Z，n=10)，M組每天灌胃給予0.5%的CMC-Na溶液，同時Z組灌胃給予濃度為0.162 g/mL的知柏地黃丸溶液，C組每天給予0.5% CMC-Na溶液，持續(xù)7 d。

2.3 生物樣品制備

所有動物采樣前禁食12 h，并自由飲水，腹腔注射3%戊巴比妥那麻醉，肝門靜脈取血，靜置30 min后，離心取血清(4 ℃，3 500 r/min，15 min)，所有血清樣品均采用甲醇沉淀法進行蛋白去除[11]，并采用0.22 μm微孔濾膜過濾后進行分析。

2.4 基礎(chǔ)代謝與生化指標檢測

治療開始后，每日記錄大鼠的體質(zhì)量變化。實驗最后一天，將各組大鼠放入小動物能量代謝儀中，24 h后取出，標準化測量各組大鼠的飲食量、飲水量、耗氧量、呼出量、總能量消耗與自主活動總量等基礎(chǔ)代謝指標。生化指標采用全自動生化分析儀進行分析，檢測過程中嚴格按照操作說明執(zhí)行。

2.5 代謝組學分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相A為0.1%甲酸-乙腈，流動相B為0.1%甲酸-水；洗脫梯度：0～1.5 min，2%～16% A，1.5～2 min，16%～20% A，2～4 min，20%～60% A，4～5 min，60%～70% A，5～8 min，70%～75% A，8～9.5 min，75%～99%。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下：毛細管電壓為2.6 kV；錐孔電壓為40 V；離子源溫度為110 ℃；脫溶劑氣溫度為350 ℃，脫溶劑氣流量為600 L/h；錐孔反吹氣流量為50 L/h。負離子模式下：毛細管電壓為2.4 kV；錐孔電壓為40 V；離子源溫度為110 ℃；脫溶劑氣溫度為350 ℃，脫溶劑氣流量為600 L/h；錐孔反吹氣流量為50 L/h。數(shù)據(jù)采集設置為0.2 s，掃描延遲為0.1 s。質(zhì)量數(shù)據(jù)采集范圍為50～1 200 Da。為獲準確的質(zhì)量采集，在4 ng/mL的濃度下采用亮氨酸腦啡肽進行質(zhì)量鎖定，在10 mL/min的流速下通過鎖定噴霧界面進行使用，以確保MS分析的準確性。

2.6 體內(nèi)成分分析的樣品前處理

取大鼠血清2 mL，精密加入40 μL磷酸，超聲處理1 min，渦旋混勻30 s后，上樣到預先以2 mL甲醇、2 mL水活化平衡好的HLB固相萃取小柱上，適當加壓緩慢成滴通過小柱，以2 mL水淋洗，洗液棄去，再以2 mL純甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，40 ℃下氮氣吹干，殘渣以150 μL濃度為60%甲醇復溶，在4 ℃，13 000 r/min離心15 min，取上清液作為供試品溶液進UOLC-Q-TOF-MS分析。

2.7 知柏地黃丸體內(nèi)分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫： 30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：4 μL；流動相A為0.1%甲酸-乙腈，流動相B為0.1%甲酸-水；洗脫梯度：0～1.5 min，2%～16% A，1.5～5 min，16%～20% A，5～8 min，20%～27% A，8～11 min，27%～30% A，11～15 min，30%～70% A，15～18 min，70%～99%。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下：毛細管電壓為3.0 kV；錐孔電壓為30 V；離子源溫度為110 ℃；脫溶劑氣溫度為350 ℃，脫溶劑氣流量為600 L/h；錐孔反吹氣流量為50 L/h。負離子模式下：毛細管電壓為2.8 kV；錐孔電壓為40 V；離子源溫度為110 ℃；脫溶劑氣溫度為350 ℃，脫溶劑氣流量為600 L/h；錐孔反吹氣流量為50 L/h。數(shù)據(jù)采集設置為0.2 s，掃描延遲為0.1 s。質(zhì)量數(shù)據(jù)采集范圍為50～1 200 Da。為獲準確的質(zhì)量采集，在4 ng/mL的濃度下采用亮氨酸腦啡肽進行質(zhì)量鎖定，在10 mL/min的流速下通過鎖定噴霧界面進行使用，以確保MS分析的準確性。

2.8 數(shù)據(jù)處理

2.8.1 統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.8.2 生物標記物分析

經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS提取代謝數(shù)據(jù)，所得血液ESI-MS代謝輪廓數(shù)據(jù)導入Progenensis QI軟件后，進行數(shù)據(jù)的前處理，所得離子進一步進行PCA分析，得到Score plot圖，隨后利用EZinfo 2.0軟件進行OPLS-DA分析，根據(jù)所得vip圖，并結(jié)合組間差異t檢驗的分析結(jié)果，確定潛在生物標記物，進而依據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)檢索，最終利用Masslynx 4.1軟件Massfragment模塊對圈定的生物標記物進行二級結(jié)構(gòu)驗證[12]。

2.8.3 血中移行成分分析

通過QI軟件處理后，利用EZinfo軟件對各組數(shù)據(jù)進行進一步的PCA分析及OPLS-DA分析，隨后進行S-plot及Variables-Trend分析，同時依據(jù)Masslynx 4.1軟件中的Metabolynx模塊，最終確定知柏地黃丸治療腎陰虛證模型的有效狀態(tài)下血中移行成分[13]。

2.8.4 關(guān)聯(lián)性分析

采用血清化學成分與代謝標記物關(guān)聯(lián)性性分析法[14-15](Plotting of Correlation between Marker Metabolites and Serum Constituents，PCMS)，對知柏地黃丸顯效成分與腎陰虛證生物標記物進行關(guān)聯(lián)，以相關(guān)系數(shù)r1為0.6和r2為0.7進行設定，確定0.6≤r≤1為潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選標準，圈定治療腎陰虛證模型的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié)果

3.1 模型評價結(jié)果分析

兩組大鼠的初始體質(zhì)量沒有顯著性差異。但自造模的第二天開始，模型組體質(zhì)量開始迅速下降，與空白對照組相比，差異極顯著(P<0.01),見表1。模型組的耗氧量、二氧化碳呼出量和呼吸商均有極顯著性差異，并呈下降趨勢(P<0.01)。模型組大鼠飲水量極顯著性增加(P<0.01)，攝食量和能量消耗量極顯著性減少(P<0.01)。模型組在運動方面有極顯著性差異(P<0.01)，具體分析結(jié)果如表2所示。模型組與空白對照組比較，cAMP、cGMP、CORT、17-OHCS、血清肌酐均有明顯變化，各項變化均有顯著或極顯著性差異(P<0.01,P<0.05)，具體分析結(jié)果見表2。綜上所述，模型組大鼠體質(zhì)量減輕、運動量減少、無食欲、飲水量增加、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)發(fā)生改變，與臨床患者的病理表現(xiàn)相符，大鼠腎陰虛證模型復制成功。

3.2 代謝組學分析結(jié)果

模型復制成功后，對空白對照組與模型組進行血液代謝輪廓分析，得到相應的PCA與OPLS-DA得分圖和S&VIP-plot圖，如圖1所示。依據(jù)二級質(zhì)譜信息聯(lián)合數(shù)據(jù)庫分析，最終共表征腎陰虛大鼠模型的血液代謝標記物26個，具體信息如表3所示。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化

表2 各組大鼠基礎(chǔ)代謝與生化指標變化

注：A.正離子模式；B.負離子模式；自上而下分別為大鼠PCA分析、大鼠OPLS-DA分析、大鼠S&VIP-plot分析。圖1 生物標記物的分析鑒定

3.3 藥物有效性評價分析

在體質(zhì)量方面，如表4所示，知柏地黃丸治療組與空白對照組在最后一天沒有顯著性差異。但模型組體質(zhì)量上升緩慢，直至最后一天，仍與空白對照組保持顯著性差異(P<0.05)。基礎(chǔ)代謝結(jié)果顯示，與空白對照組相比，知柏地黃丸治療組各項差異均無顯著性。但模型組的耗氧量、呼出二氧化碳量、呼吸熵、能量消耗、自主活動、飲食量與飲水量等各項指標則差異極為顯著(P<0.01)。生化分析結(jié)果表明，知柏地黃丸治療組各指標與空白對照組比較，差異均無顯著性，而模型組與空白對照組比較時，發(fā)現(xiàn)cAMP、cGMP、CORT等各項生化指標顯著性明顯(P<0.05),見表5。綜上所述，知柏地黃丸治療組，經(jīng)過治療后，大鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，運動量顯著提高，食欲增加，飲水量減少，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)紊亂出現(xiàn)回調(diào)。而模型組仍然保持顯著的病理狀態(tài)，上述結(jié)果表明知柏地黃丸治療腎陰虛證的療效是肯定的。

3.4 知柏地黃丸血中移行成分分析

如圖2所示，空白對照組與模型組區(qū)分明顯，說明模型組大鼠的代謝擾動仍然存在，而知柏地黃丸治療組的矢量位置趨近對照組，說明經(jīng)過治療后，知柏地黃丸對腎陰虛證模型大鼠起到明顯改善作用，在26個血液潛在生物標記物中，經(jīng)過知柏地黃丸治療后，共有19個發(fā)生顯著性回調(diào)，見圖3。隨后，利用UPLC-HDMS技術(shù)對知柏地黃丸治療腎陰虛有效狀態(tài)下的血中移行成分進行分析，共發(fā)現(xiàn)了38個原型成分入血，9個為代謝成分，詳細信息見表6和表7。

表3 腎陰虛模型大鼠血液代謝標記物的具體信息表

表4 各組大鼠治療期的體質(zhì)量變化

表5 各組大鼠治療期的基礎(chǔ)代謝與生化指標變化

注：A.正離子模式；B.負離子模式;C.空白對照組，M.模型組，Z.知柏地黃丸治療組。圖2 各組大鼠血液代謝輪廓分析圖

注:C.空白對照組，M.模型組，Z.知柏地黃丸治療組；與C組大鼠比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 各組大鼠血液代謝標記物含量變化圖

表6 原型入血成分分析表征結(jié)果

續(xù)表6

表7 藥物代謝成分分析表征結(jié)果

3.5 知柏地黃丸治療腎陰虛證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

將中藥血清中移行成分與生物標記物含量變化合并導入PCMS軟件，通過雙變量BCA分析。設置本試驗研究相關(guān)系數(shù)1為0.6，相關(guān)系數(shù)2為0.7，如圖4所示，其中10個為極度相關(guān)性成分，1個為高度相關(guān)性成分，極度相關(guān)性成分分別為：棉子糖、沒食子酸、1,7-O-沒食子酸-D-景天庚酮糖、澤瀉醇B單乙酸酯、四氫胡蘿卜素-O-葡萄糖醛酸鹽、小檗堿-O-硫酸鹽-O-葡萄糖醛酸鹽，藤本代謝物為高度相關(guān)性成分，以上11個成分為知柏地黃丸治療腎陰虛證模型大鼠的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)Q-marker的基本條件，Q-marker應具有獨特的固有成分，并保持清晰的化學結(jié)構(gòu)，具有生物活性，可進行定性和定量分析，符合中藥配伍理論。最后，確定知柏地黃丸治療腎陰虛證的質(zhì)量標志物為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)中的原型成分：丹皮酚、沒食子酸、棉子糖、芍藥苷、藥根醇、澤瀉醇B單乙酸酯。

圖4 知柏地黃丸血中移行成分與腎陰虛模型血液潛在生物標記物的相關(guān)性分析

4 討論

通過代謝組學的研究方法，共找到26個腎陰虛血液代謝標記物，主要與花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、類固醇激素生物合成、戊糖與葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、淀粉和蔗糖代謝、糖基磷脂酰肌醇、鞘脂代謝、視黃醇代謝、丁酸代謝、一級膽汁酸生物合成相關(guān)。

其中PGH3(前列腺素H3)、Prostaglandin A1(前列腺素A1)、Prostaglandin B2(前列腺素B2)與花生四烯酸均屬于花生四烯酸代謝通路?；ㄉ南┧崾侨梭w內(nèi)一種必須脂肪酸，也是一種重要的不飽和脂肪酸，花生四烯酸主要以磷脂的形式存在于細胞膜上[16-17]。在正常狀態(tài)下，游離的花生四烯酸含量較低，但當細胞膜受到各種刺激時，花生四烯酸便從細胞膜磷脂池中被釋放出來，在環(huán)氧酶的作用下，經(jīng)合成不穩(wěn)定的環(huán)內(nèi)過氧化合物后，形成PGH2，最后由PGH2形成多種前列腺素物質(zhì)，參與多種前列素的合成。而前列腺素作用廣泛，可以通過抑制內(nèi)分泌細胞中環(huán)腺苷酸(cAMP)的釋放水平，進而影響激素的合成與釋放，例如促使甲狀腺素分泌和腎上腺皮質(zhì)激素的合成等，從此點講，腎陰虛與神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂具有密切的關(guān)系[18]。

糖代謝是指葡萄糖、糖原等在體內(nèi)的一系列復雜的化學反應，是機體中糖的主要來源,與人體的生命活動息息相關(guān)[19-21]。機體內(nèi)糖代謝途徑有很多，其中糖醛酸途徑以及淀粉和蔗糖代謝在葡萄糖代謝中占有一部分作用[22]。本實驗在氫化可的松的作用下，線粒體的功能處于紊亂狀態(tài)，從而導致能量代謝(糖代謝)紊亂。在本實驗中模型組戊糖喝葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化的過程當中發(fā)現(xiàn)標記物5-羥基-6-甲氧基吲哚葡萄糖醛酸含量低表達，推測模型組內(nèi)大鼠可能出現(xiàn)一定低血糖的癥狀。