刁一芮 丁 奇 許功灝 章 晨 朱文翔 曲思昊 王 路 張彬彬 史淵源，△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院，廣東 深圳 518118）

急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種繼發(fā)于肺內(nèi)或全身的炎癥反應(yīng)過程，由肺泡損傷導(dǎo)致并形成炎性非心源性的肺水腫［1-2］，并引起急性低氧血癥的一種臨床綜合征。ALI/ARDS最常見于肺炎、敗血癥、胃內(nèi)容物誤吸或嚴(yán)重外傷，約占全世界重癥監(jiān)護(hù)病房患者的 10%［1］，死亡率仍高達(dá) 30%～40%［3］?，F(xiàn)公認(rèn)診斷標(biāo)準(zhǔn)為2012年柏林定義（Berlin definition），在低氧血癥的基礎(chǔ)上，急性呼吸窘迫綜合征輕度：200<動(dòng)脈血氧分壓與吸入氧氣之比（PaO2/FiO2）≤300 mmHg）；中度：100

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 本文主要應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫包括：PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、ChemBioDraw軟件、SwissTargetPrediction平臺(tái)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）、Cytoscape 3.7.2軟件、DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncif?crf.gov/）、bioinformatics（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在線工具以及Autodock vina軟件。

1.2 研究方法 1）參麥注射液活性成分篩選以及分子信息收集。通過文獻(xiàn)研究對(duì)參麥注射液中的主要活性成分進(jìn)行篩選，進(jìn)一步通過PubChem數(shù)據(jù)庫、Chem?BioDraw軟件獲得主要化合物的基本信息。2）參麥注射液相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。將篩選后的參麥注射液中的活性成分作為研究對(duì)象，利用SwissTargetPrediction平臺(tái)和GeneCards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白的收集。3）ALI/ARDS相關(guān)疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“Acute lung injury”或“Acute respiratory distress syn?drome”進(jìn)行檢索（相關(guān)性評(píng)分≥40），收集ALI/ARDS相關(guān)疾病靶點(diǎn)。4）參麥注射液與ALI/ARDS蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。將參麥注射液治療ALI/ARDS的潛在靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，選擇種屬為Homo sapiens，輸出結(jié)果后下載為TSV格式文件，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)參數(shù)“betweenness”“closeness”和“degree”中位數(shù)進(jìn)而篩選參麥注射液治療ALI/ARDS的關(guān)鍵靶點(diǎn)。5）核心靶點(diǎn)的基因功能（GO）分析及KEGG通路富集分析。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)參麥注射液治療ALI/ARDS的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG信號(hào)通路富集分析后，通過bioinformatics在線工具制作高級(jí)氣泡圖進(jìn)行可視化分析。6）參麥注射液治療ALI/ARDS的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建?；贑ytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物“成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖，將參麥注射液治療ALI/ARDS的化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)、相關(guān)通路及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合。7）參麥注射液中活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接。從RCSB PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫和PubChem分別獲得靶點(diǎn)蛋白和各化合物的三維結(jié)構(gòu)，采用AutoDock Tools對(duì)蛋白受體和配體進(jìn)行常規(guī)處理后，進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能（affinity）。根據(jù)文獻(xiàn)記載［10］，認(rèn)為≤-4.25 kcal/mol說明配體與受體有一定的結(jié)合活性，以結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol為具有較強(qiáng)結(jié)合活性，結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol為具有強(qiáng)結(jié)合活性。

2 結(jié) 果

2.1 成分收集 通過文獻(xiàn)研究［6，11］，人參皂苷和麥冬皂苷是參麥注射液的主要發(fā)揮治療作用的活性成分，進(jìn)而選取了28個(gè)人參皂苷類成分、5個(gè)麥冬皂苷成分以及2個(gè)麥冬黃酮類成分作為研究對(duì)象。并通過Pub?Chem數(shù)據(jù)庫、ChemBioDraw軟件獲得35個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)（見表1）。

表1 參麥注射液中主要化合物的基本信息

2.2 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過SwissTargetPrediction平臺(tái)和GeneCards數(shù)據(jù)庫對(duì)收集的35個(gè)參麥注射液活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白的預(yù)測(cè)，排除重復(fù)項(xiàng)后，共收集參麥注射液成分相關(guān)靶點(diǎn)371個(gè)。

2.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫收集ALI/ARDS相關(guān)靶點(diǎn)，排重后共得到164個(gè)ALI/ARDS相關(guān)靶點(diǎn)。成分相關(guān)靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)交集后得到57個(gè)交集靶點(diǎn)（圖1）。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為人，置信度0.4，輸出結(jié)果中含有56個(gè)靶點(diǎn)并排除一個(gè)相關(guān)性小的靶點(diǎn)，輸出TSV格式結(jié)果并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，利用Network Analyzer進(jìn)一步網(wǎng)絡(luò)分析。如圖2所示，PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共有56個(gè)節(jié)點(diǎn)、848條邊，節(jié)點(diǎn)大小對(duì)應(yīng)degree大小，節(jié)點(diǎn)由暗變亮degree變大。為了進(jìn)一步篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，以（Betweenness>0.00308，Closeness>0.679012，Degree>30）中位數(shù)作為篩選條件，共獲得26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖1 參麥注射液靶點(diǎn)與ALI/ARDS相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖

圖2 參麥注射液治療ALI/ARDS潛在靶點(diǎn)的PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的功能及通路分析 將26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID平臺(tái)，物種設(shè)置為人，進(jìn)行GO功能分析。根據(jù)Pvalue得到167個(gè)生物過程（BP），主要涉及基因轉(zhuǎn)錄、凋亡調(diào)控、細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)激和蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)等（按P value選擇前10。圖3A）。KEGG通路富集得到相關(guān)通路94條，結(jié)果顯示富集得到的通路主要涉及炎癥和免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和激素調(diào)節(jié)等。其中炎癥和免疫反應(yīng)包括HIF-1通路、PI3K-Akt通路和TNF通路等，細(xì)胞凋亡涉及FoxO通路、p53通路和ErbB通路等，激素調(diào)節(jié)涉及甲狀腺激素通路和催乳素通路（去除人類疾病后，按P value選取前10。圖3B）。

圖3 氣泡圖

2.5 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò) 將參麥注射液的成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)以及相關(guān)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)（圖4）。該網(wǎng)絡(luò)具有76個(gè)節(jié)點(diǎn)和364條邊。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中平均鄰居數(shù)（Ave.number of numbers）為9.838，網(wǎng)絡(luò)的中心性（cen?tralization）為0.368，異質(zhì)性（heterogeneity）為0.766。提示成分-靶點(diǎn)-通路空間上趨向于某些成分、靶點(diǎn)和通路，體現(xiàn)中醫(yī)治療具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。紅參成分中度值較大的有Ginsenoside Rb1（de?gree=24）、Ginsenoside Re（degree=21）和Ginsenoside Ro（degree=21），麥冬中度值較大的有Methylophiopogona?none B（degree=4）、Ophiopogonin D（degree=4）和Ophio?pogonin D′（degree=4）。度值前5的靶點(diǎn)分別為STAT3、VEGFA、Akt1、MAPK1、TNF，這可能是參麥注射液發(fā)揮治療作用的主要靶點(diǎn)。

圖4 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 活性成分和靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇參附注射液成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)中度值排名靠前的靶點(diǎn)蛋白（STAT3、VEGFA和Akt1）與參麥注射液中成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。根據(jù)Autodock vina軟件的結(jié)果參麥注射液成分與STAT3、VEGFA和MAPK1對(duì)接的結(jié)合能范圍是-4.4～-10（圖5），表明了成分與靶點(diǎn)之間良好的結(jié)合能力（圖6）。

圖5 靶點(diǎn)-成分-結(jié)合能評(píng)分熱圖

圖6 分子對(duì)接模式圖

3 討 論

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，并無ARDS的相關(guān)記載，但可根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸于“暴喘”“喘脫”等范疇。本病多因新感、外傷、諸毒、六淫、病氣等外邪所致，多有肺腎氣絕之象［12］。而參麥注射液中人參、麥冬生脈，益氣固脫，有助于調(diào)暢氣機(jī)、調(diào)節(jié)陰陽平衡?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中，肺泡巨噬細(xì)胞分泌促炎因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）［3］等，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞募集，同時(shí)肺泡上皮細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞活化以及微血管損傷進(jìn)一步促進(jìn)了肺部炎癥以及ARDS屏障破裂［13］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)參麥注射液可以通過清除氧自由基、抑制促炎因子水平以及增強(qiáng)免疫發(fā)揮治療作用［14］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)參麥注射液治療ALI/ARDS的分子機(jī)制進(jìn)行探討。通過文獻(xiàn)篩選的方法得到了35個(gè)參麥注射液的有效成分，且這些有效成分已被證實(shí)影響各種涉及炎癥和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)機(jī)制，如人參皂苷Rg1可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥并顯著抑制TNF和IL-6等炎性因子，進(jìn)而有效緩解膿毒癥所致的肺損傷［15］；麥冬皂苷Ophiopogonin D被報(bào)道可以激活A(yù)MPK并下調(diào)NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而改善肺部炎癥［16］。

PPI網(wǎng)絡(luò)以及核心靶點(diǎn)顯示，參麥注射液的有效成分靶點(diǎn)主要為 STAT3、VEGFA、Akt1、MAPK1、TNF等，且分子對(duì)接證實(shí)MAPK1、STAT3、VEGFA與各成分之間具有良好的結(jié)合能力。MAPK1沉默可以減輕LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥性損傷［17］。STAT 3選擇性抑制劑LLL 12能明顯改善LPS誘導(dǎo)的ALI模型的組織病理學(xué)特征，改善肺水腫和肺血管滲漏［18］。VEGFA既是血管內(nèi)皮生長因子也是促炎因子，在ALI中一方面促進(jìn)急性炎癥反應(yīng)和肺水腫，另一方面又保護(hù)肺泡上皮屏障，其作為ALI/ARDS的治療靶點(diǎn)應(yīng)更為謹(jǐn)慎［19］。

根據(jù)KEGG通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)炎癥和免疫反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡相關(guān)通路最多，表明參麥注射液主要通過抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫和調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用。其中PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路以及TNF信號(hào)通路與肺部炎癥關(guān)系最為密切。已有研究證實(shí)通過PI3K/Akt通路可以抑制巨噬細(xì)胞Nlrp3炎癥體激活進(jìn)而減輕ALI［20］。由于肺部炎癥和缺氧都會(huì)促進(jìn)ALI的發(fā)作和發(fā)展，HIF-1作為缺氧缺血（H-I）關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，HIF-1通過調(diào)控PI3K/HIF通路維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)可以保護(hù)細(xì)胞免受H-I介導(dǎo)的損傷［21］，另外靶向HIF-1α可抑制TLR4表達(dá)和巨噬細(xì)胞炎癥，提示HIF-1α激活劑可能具有治療ALI的前景［22］。TNF-α作為TNF家族中研究得最多的細(xì)胞因子，TNF-α信號(hào)通路會(huì)誘發(fā)和加劇炎癥反應(yīng)，并通過促進(jìn)TNFR1與相關(guān)死亡域蛋白結(jié)合而引發(fā)細(xì)胞死亡［23］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法以及分子對(duì)接技術(shù)探討了參麥注射液在ALI/ARDS中的潛在分子機(jī)制。這些潛在成分、靶點(diǎn)以及通路可能具有減輕肺部炎癥、減緩ALI/ARDS進(jìn)程，進(jìn)而從整體上發(fā)揮治療ALI/ARDS的作用，為中西醫(yī)結(jié)合治療危重癥提供了研究基礎(chǔ)。