孔 瑜， 段 鋒， 吳 達(dá)， 張西華

(1. 上海第二工業(yè)大學(xué)電子廢棄物研究中心 資源循環(huán)科學(xué)與工程中心上海電子廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，上海201209;2.中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所環(huán)境技術(shù)與工程研究部 北京市過程污染控制工程技術(shù)研究中心，北京 100190;3.華北制藥華勝有限公司，河北 石家莊 052160)

0 引言

環(huán)境中的抗生素主要來自人類和動(dòng)物用藥、工業(yè)生產(chǎn)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)院、污水處理廠等點(diǎn)源，再通過農(nóng)業(yè)、城市等徑流向環(huán)境中擴(kuò)散.目前，地表水、地下水、海水、土壤中常常有痕量抗生素的檢出，抗生素已經(jīng)成為環(huán)境中的新興污染物之一[1-3]，其大量排放可能導(dǎo)致抗性細(xì)菌(ARBs)和抗性基因(ARGs)的產(chǎn)生，從而具有潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[4-6].β-內(nèi)酰胺類抗生素是生產(chǎn)和使用最廣泛的一類抗生素，主要包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類、碳青霉烯類和青霉烯類酶抑制劑等[7].目前廢水和環(huán)境水體中β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，文獻(xiàn)中多采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析水環(huán)境中抗生素殘留，如文獻(xiàn)[8-10]中采用上述方法同時(shí)檢測(cè)環(huán)境水體中多種β-內(nèi)酰胺類抗生素，采用固相萃取預(yù)處理或者直接進(jìn)樣，檢出限約為1 ng/L.由于制藥廢水中抗生素殘留濃度水平為μg/L～mg/L[11-14]，通常采用高效液相色譜法即可以滿足檢出限要求[15].質(zhì)譜儀分析費(fèi)用高，難以滿足制藥企業(yè)日常監(jiān)測(cè)分析的要求，而多種抗生素分別通過高效液相色譜法來檢測(cè)，時(shí)間耗費(fèi)長(zhǎng)，因此，需要建立一種操作簡(jiǎn)便的分析方法，用于廢水中多種β-內(nèi)酰胺類抗生素的同步檢測(cè).

本研究采用固相萃取-高效液相色譜法，建立了制藥廢水中三種典型β-內(nèi)酰胺類抗生素美羅培南、普魯卡因青霉素、頭孢唑林鈉的同步檢測(cè)方法，并對(duì)固相萃取及液相色譜操作條件進(jìn)行了優(yōu)化.該方法精密度和準(zhǔn)確度符合要求，檢出限低，經(jīng)驗(yàn)證可用于制藥廢水中殘留抗生素的檢測(cè)，滿足企業(yè)檢測(cè)分析需求.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：美羅培南(>98%，上海麥克林生化科技有限公司)、普魯卡因青霉素(>96%，某藥企提供)、頭孢唑林鈉(>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司).甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，乙酸銨、乙酸、鹽酸、氨水(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).實(shí)驗(yàn)用水均為超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與分析儀器

實(shí)驗(yàn)所用主要設(shè)備與儀器有1200 Infinity Series型高效液相色譜儀，采用G1365C/D多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(美國(guó)Agilent 公司)，Agilent ZORBAX SB-AQ液相色譜柱(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)，Agilent ZORBAX EXTEND C18液相色譜柱(3.5 μm，4.6 mm×150 mm)，Extrapid型固相萃取儀、C18 固相萃取柱(6 mL/500 mg，北京萊伯泰科儀器有限公司)，Oasis HLB固相萃取柱(6 mL/500 mg，美國(guó)Waters公司)，DC150-1氮吹儀(杭州佑寧儀器有限公司)，EL20K型pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制美羅培南(MERO)、普魯卡因青霉素(PROP)、頭孢唑林鈉(CFZS)分別配置成100 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，密封后放入-20 ℃的冰箱避光保存.每次實(shí)驗(yàn)前取出三種單標(biāo)儲(chǔ)備液配制成20 mg/L的混標(biāo)工作液，溶液均用超純水定容.

1.3.2 固相萃取預(yù)處理方法固相萃取預(yù)處理方法參考文獻(xiàn)[6].將水樣用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH，用0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾，將100 mL水樣以3～4 mL/min的流速連續(xù)通過固相萃取柱，始終使萃取柱水樣高度大于1 cm，上樣流速應(yīng)保持恒定，然后用10 mL的超純水以3 mL/min的流速淋洗，繼續(xù)真空抽吸直到萃取柱完全干燥.最后用一定體積甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于樣品管中，高純氮?dú)獯抵两桑? mL的超純水定容，避光保存在-20 ℃的冰箱中.通過改變固相萃取柱類型、固相萃取pH條件、甲醇洗脫溶液體積來優(yōu)化固相萃取操作條件.

1.3.3 高效液相色譜方法流動(dòng)相由二元混合體系組成，其中水相為20 mmol/L的乙酸銨-乙酸溶液，有機(jī)相為乙腈，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm.通過改變液相色譜柱類型、流動(dòng)相比例、pH、流速來優(yōu)化高效液相色譜條件.

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件優(yōu)化

2.1.1 固相萃取柱的選擇美羅培南、普魯卡因青霉素、頭孢唑林鈉均含有羧基或氨基，具有兩性分子的特性.目前許多研究都證明了兩親性的HLB固相萃取柱對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素有良好的回收率[16-17].本文選用HLB和C18固相萃取柱對(duì)三種混合抗生素進(jìn)行萃取，回收率如圖1所示.結(jié)果表明，HLB固相萃取柱的萃取效率明顯高于C18，尤其是針對(duì)美羅培南和普魯卡因青霉素，HLB柱的回收效率為60%～90%，而C18柱的回收效率小于25%.HLB和C18萃取柱對(duì)于頭孢唑林鈉的回收率差別較小，分別是83.0%和68.6%.HLB固相萃取柱的吸附材料是由親水性的N-乙烯基吡咯烷酮和親脂性二乙烯苯共聚物組成，比表面積大，對(duì)極性混合物保留效果較好，可適用的pH范圍較寬，由于親水單體的存在，可使填料的潤(rùn)濕性增加，活化的時(shí)間縮短.由于HLB柱的吸附材料是由親水性的N-乙烯基吡咯烷酮和親脂性二乙烯苯共聚物組成，比表面積大，對(duì)極性混合物保留效果較好，可適用的pH范圍較寬.根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇HLB固相萃取柱對(duì)水樣進(jìn)行萃取.

圖1 固相萃取柱類型對(duì)抗生素回收率的影響Fig.1 Effect of the type of solid phase extraction column on antibiotics recovery rate

2.1.2 固相萃取pH的選擇水樣的pH是影響抗生素在固相萃取柱上吸附的重要條件，由于抗生素在不同pH條件下呈現(xiàn)離子或分子形態(tài)，通過調(diào)節(jié)pH使目標(biāo)物質(zhì)呈現(xiàn)分子狀態(tài)，在疏水相互作用下被萃取柱保留，離子態(tài)的雜質(zhì)不能有效地吸附而被去除.用鹽酸和氨水依次將固相萃取前水樣的pH調(diào)節(jié)為3、4、5、7、9，結(jié)果如圖2所示.可以看出，普魯卡因青霉素在不同pH條件下的回收率保持在80%以上，高于美羅培南和頭孢唑林鈉，原因可能是固相萃取柱對(duì)普魯卡因的保留效果好，普魯卡因上的-NH2基團(tuán)可以被HLB萃取柱上的親水基團(tuán)所吸引，苯環(huán)還可以與二乙烯苯產(chǎn)生π-π 相互作用，增強(qiáng)了吸附效果.頭孢唑林鈉在不同pH條件下的回收率保持在68%～83%之間，在酸性條件下的回收率高于中性和堿性.美羅培南在酸性、中性、堿性條件下的回收率均不高，并且中性和堿性的環(huán)境對(duì)該抗生素的影響更大，有研究指出碳青霉烯類抗生素尤其是美羅培南對(duì)pH變化較為敏感，在溶液中不穩(wěn)定[18-19].綜上，在pH為3～5弱酸環(huán)境中，三種抗生素的固相萃取回收率保持在59.1%～89.2%之間，最終選擇將固相萃取上樣前水樣的pH調(diào)節(jié)為4.

圖2 水樣pH對(duì)抗生素回收率的影響Fig.2 Effect of pH of solid phase extraction on antibiotics recovery rate

2.1.3 洗脫溶液體積的選擇分別用6 mL、8 mL、10 mL、12 mL純甲醇溶液對(duì)HLB固相萃取柱進(jìn)行洗脫，研究不同洗脫液體積對(duì)固相萃取回收率的影響，結(jié)果如圖3所示.結(jié)果表明，洗脫溶液體積為6 mL和10 mL時(shí)，美羅培南的回收率分別為53.8%和61.5%，頭孢唑林鈉的回收率分別為77.3%和83.0%；洗脫溶液體積為8 mL時(shí)，普魯卡因青霉素回收率最高可以達(dá)到94.4%.甲醇作為質(zhì)子溶劑，可與物質(zhì)形成氫鍵，增強(qiáng)洗脫效果.在洗脫過程中，如果洗脫溶液體積過少，不能完全將目標(biāo)成分洗脫；洗脫溶液體積過多，造成溶液的浪費(fèi)，增加固相萃取的時(shí)間，還可能將其他干擾雜質(zhì)洗脫下來，最終影響目標(biāo)物質(zhì)的分析.綜合考慮選擇10 mL作為固相萃取最佳洗脫溶液用量.

圖3 洗脫液體積對(duì)抗生素回收率的影響

2.2 高效液相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇本文采用了可以耐高水相未封端的Agilent ZORBAX SB-AQ(3.5 μm,2.1 mm×150 mm)和雙封端的Agilent ZORBAX EXTEND C18(3.5 μm, 4.6 mm×150 mm)兩種親水性色譜柱進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖4所示，可以看出， EXTEND C18色譜柱峰形、分離度明顯優(yōu)于SB-AQ色譜柱.圖4(a)的色譜峰拖尾嚴(yán)重，三種抗生素的峰形沒有完全分離.相反地，圖4(b)的色譜峰尖銳無拖尾，而且峰高相比圖4(a)高出很多，提高了抗生素檢測(cè)的靈敏度.EXTEND C18色譜柱采用雙齒鍵合、雙封端的形式修飾C18色譜柱，最大程度降低了硅膠基質(zhì)表面的硅羥基對(duì)極性基團(tuán)的吸引作用，而SB-AQ色譜柱未封端的硅羥基與目標(biāo)分析物中的極性基團(tuán)產(chǎn)生了靜電作用力，導(dǎo)致色譜峰拖尾.所以最終選擇封端的EXTEND C18色譜柱進(jìn)行分析.

圖4 高效液相色譜圖：(a)SB-AQ色譜柱，(b)EXTEND-C18色譜柱Fig.4 HPLC chromatograms with (a) SB-AQ column and (b) EXTEND C18 column

2.2.2 流動(dòng)相比例及pH的選擇液相色譜水相流動(dòng)相為乙酸銨-乙酸混合溶液，有機(jī)相為乙腈.實(shí)驗(yàn)采用等度洗脫的模式，水相和有機(jī)相的比例分別設(shè)置為90%∶10%、80%∶20%、70%∶30%，同時(shí)分別用乙酸和氨水將水相pH調(diào)為4、4.5、5、5.5和10，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.由圖5(a)所示，流動(dòng)相中有機(jī)相的比例越高，洗脫強(qiáng)度越大，目標(biāo)物質(zhì)的出峰時(shí)間越靠前，在有機(jī)相比例提高的情況下，目標(biāo)抗生素分成了多個(gè)峰，不符合實(shí)驗(yàn)的分析要求.因此水相與有機(jī)相的最佳比例為90%∶10%.從圖5(b)可以看出在偏酸性的條件下物質(zhì)的峰形較好，分離度較高.隨著pH的提高，目標(biāo)抗生素的出峰時(shí)間提前，還可能發(fā)生了解離.這是由于抗生素在不同pH條件下呈現(xiàn)離子或分子形態(tài)，通過調(diào)節(jié)pH使目標(biāo)物質(zhì)呈現(xiàn)分子狀態(tài)，從而在色譜柱上得到有效分離.對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在pH=4的條件下抗生素的峰面積更高，靈敏度更好，所以將流動(dòng)相中水相的最佳pH設(shè)定為4.

圖5 高效液相色譜圖：(a)不同流動(dòng)相比例，(b)不同流動(dòng)相pH條件Fig.5 HPLC chromatograms of (a) different mobile phase composition and (b) different mobile phase pH

2.2.3 流速的選擇為了縮短分析時(shí)間，提高分析效率，可將流速提高.因此，設(shè)置了0.25 mL/min、0.3 mL/min、0.35 mL/min、0.4 mL/min、0.5 mL/min五個(gè)流速.結(jié)果顯示，隨著流速的增加，三種抗生素的出峰時(shí)間越來越靠前，大大提高了分析的效率，但是流速越快，保留越弱，峰面積也越來越小，最終影響物質(zhì)的檢出限和靈敏度.考慮到分析效率和靈敏度的問題，選擇0.4 mL/min作為HPLC最佳流速，可將單個(gè)樣品的分析時(shí)間縮短至20 min以內(nèi)，美羅培南、普魯卡因青霉素、頭孢唑林鈉的出峰時(shí)間分別為5.8 min、10.1 min、16.9 min.

2.3 方法的評(píng)價(jià)與驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線本文采用外標(biāo)法，將20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.8 mg/L、0.5 mg/L、0.2 mg/L的混標(biāo)稀釋液依次進(jìn)樣(n=3)，三種β-內(nèi)酰胺類抗生素的峰形較好，分離度較高.以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析(n=3)，結(jié)果如表1所示.三種抗生素在0.2 ～20 mg/L之間的相關(guān)系數(shù)(R2)均達(dá)到了0.999 0，線性關(guān)系良好.

表1 β-內(nèi)酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)(n=3)

2.3.2 方法檢出限與定量限一般將色譜峰信噪比為3∶1時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度確定為儀器檢出限，信噪比為10∶1時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度確定為儀器定量限.結(jié)果表明，美羅培南、普魯卡因青霉素、頭孢唑林鈉的儀器檢出限分別為0.1 mg/L、0.15 mg/L和0.15 mg/L，儀器定量限分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L和0.5 mg/L.

方法定量限是指以某種溶液為基質(zhì)時(shí)，通過已建立的方法測(cè)到的目標(biāo)分析物的最低濃度[12]，具體如公式(1)所示.

LOQ=IQL/(RC).

(1)

式中：LOQ表示方法定量限，μg/L；IQL表示儀器定量限，mg/L；R表示回收率(%)，平均回收率見表3；C表示濃縮倍數(shù).本研究中固相萃取濃縮倍數(shù)為100倍，根據(jù)公式(1)可計(jì)算出以實(shí)際水樣為基底溶液時(shí)的方法定量限為2.65～5.87 μg/L.

表2 β-內(nèi)酰胺類抗生素檢出限和定量限

Tab.2 Detection limit and quantitative limit of β-lactam antibiotics

抗生素儀器檢出限/(mg/L)儀器定量限/(mg/L)方法定量限/(μg/L)美羅培南0.10.22.65普魯卡因青霉素0.150.55.04頭孢唑林鈉0.150.55.87

2.3.3 加標(biāo)回收率以空白水樣和抗生素污水處理廠實(shí)際水樣為基底溶液，設(shè)置0.5 mg/L、2 mg/L、10 mg/L低、中、高三個(gè)濃度水平，分別對(duì)空白水樣和實(shí)際廢水進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn).結(jié)果如表3所示，以超純水為基底溶液時(shí)，三種抗生素的回收率保持在53.2%～98.67%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6%；以實(shí)際廢水為基底溶液時(shí)，三種抗生素的回收率保持在74.67%～106%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%.回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在合理的范圍之內(nèi)，說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，在實(shí)際樣品的分析之前應(yīng)進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠.

表3 空白水樣、污水水樣加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.4 實(shí)際水樣的測(cè)定

水樣取自國(guó)內(nèi)某大型制藥企業(yè)污水處理站進(jìn)出水，該污水處理廠主要采用預(yù)處理+生化處理工藝，采用已建立的固相萃取-高效液相色譜法對(duì)廢水中殘留抗生素進(jìn)行分析，水樣檢測(cè)三次取平均值，結(jié)果如表4所示.

表4 制藥污水處理廠殘留抗生素的檢出濃度

由表4可得，在污水處理廠進(jìn)水中美羅培南、普魯卡因青霉素、頭孢唑林鈉三種抗生素的平均濃度分別為139.7 μg/L、75.1 μg/L、185.6 μg/L，經(jīng)過處理后，出水中仍然含有微量的殘留抗生素，平均濃度分別為7.0 μg/L、9.9 μg/L、18.5 μg/L，三種抗生素的去除率分別為95.0%、86.8%、90.1% .

3 結(jié) 論

(1)采用固相萃取-高效液相色譜法，建立了制藥廢水中美羅培南、普魯卡因青霉素、頭孢唑林鈉3種β-內(nèi)酰胺類抗生素的同步檢測(cè)方法，該方法定量限為2.65～5.87 μg/L，實(shí)際廢水加標(biāo)回收率為74.67%～106%，可用于制藥廢水日常檢測(cè)，抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液和廢水溶液需在-20 ℃下避光保存，且保存時(shí)間不超過48 h.

(2)采用建立的方法測(cè)得，制藥廢水經(jīng)過預(yù)處理和生化處理過程后，出水中仍然含有微量的美羅培南、普魯卡因青霉素、頭孢唑林鈉，平均濃度分別為7.0 μg/L、9.9 μg/L、18.5 μg/L，需要關(guān)注抗生素后續(xù)的遷移轉(zhuǎn)化過程.